急性腦梗死患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與預后的相關性分析

張歡,祝善堯,葛偉,洪斌,劉爽

近年來,隨著溶栓、介入等再灌注治療手段的迅速發展,急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)的治療效果得到顯著提高,但臨床實踐中仍有部分患者遺留不同程度神經功能缺損,難以獲得良好的預后[1-2]。有研究統計,ACI患者靜脈溶栓治療后近期預后不良發生率高達42.70%,需給予重視[3]。因此,及早有效預測ACI患者預后情況成為研究熱點。目前,大量研究表明,ACI患者發生發展過程中與神經功能缺損相關的環節較多,包括氧化應激反應、炎性反應、細胞凋亡等[4-5]。其中,Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-related protein-1,Keap1)-核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 correlation factor 2,Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant reaction element,ARE)是一種調控機體氧化應激反應、調節下游氧化/抗氧化因子表達的重要信號通路,能維持腦梗死后細胞內氧化還原平衡狀態[6]。但關于該信號通路與ACI患者預后的關系仍缺乏確切的證據。為此,現分析ACI患者Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與預后的相關性,旨在為臨床預測預后提供更多思路,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年6月—2022年3月安徽醫科大學附屬巢湖醫院神經內科診治 ACI患者110例作為研究對象,其中男63例,女47例,年齡48～85(66.92±3.66)歲;梗死部位:前循環68例,后循環42例;神經功能缺損評分(National Institutes of Health Stroke Score,NIHSS)5～22(14.97±2.19)分;發病至溶栓時間1～4.5(2.73±0.41)h。根據溶栓后3個月改良Rankin量表評分評估短期預后,近期預后良好患者78例,mRs評分(1.81±0.17)分,近期預后不良患者32例,mRs評分(3.35±0.33)分;隨訪1年,失訪6例,根據ACI是否復發統計,遠期預后良好患者83例,mRs評分(1.75±0.24)分,遠期預后不良患者21例,mRs評分(3.24±0.31)分。近、遠期預后良好患者mRs評分低于近、遠期預后不良患者,差異有統計學意義(t=32.212、23.898,P均<0.001)。遠期預后良好患者83例,男48例,女35例,年齡48～85(65.83±4.12)歲;發病至溶栓時間1～4.5(2.65±0.51)h;誘因:情緒劇烈波動35例,勞累26例,精神緊張15例,其他7例;合并癥:高血壓15例,糖尿病9例,高脂血癥12例。遠期預后不良患者21例,男12例,女9例,年齡49～85(67.01±4.54)歲;發病至溶栓時間1～4.5(2.77±0.53)h;誘因:情緒劇烈波動10例,勞累6例,精神緊張3例,其他2例;合并癥:高血壓5例,糖尿病3例,高脂血癥4例。2組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準(2020031286),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:發病4.5 h內,CT檢查無責任腦梗死病灶;符合ACI相關診斷標準[7];具備靜脈溶栓指征;無顱腦既往治療史。(2)排除標準:合并腦出血、腦外傷等其他顱腦疾病的患者;參與本研究4周前有服用免疫抑制劑、抗凝等藥物的患者;伴有嚴重全身性疾病的患者;存在凝血功能障礙、自身免疫疾病、呼吸道疾病的患者;合并惡性腫瘤的患者。

1.3 治療與分組 患者入院后均根據實際情況給予相應對癥治療與支持治療;發病4.5 h內給予阿替普酶靜脈溶栓治療,阿替普酶0.9 mg/kg,最大劑量控制在90 mg,靜脈注射10%,持續性靜脈泵入90%,于1 h內泵完。溶栓后24 h給予阿司匹林(拜耳醫藥保健有限公司)100 mg/d口服,阿托伐他汀20 mg/次口服,依達拉奉右莰醇30 mg+生理鹽水100 ml靜脈滴注,均為2次/d。以溶栓后3個月的改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRs)評分[8]作為近期預后的評估依據,mRs評分≤2分判定為近期預后良好,mRs評分>2分判定為近期預后不良。隨訪1年,以ACI是否復發作為遠期預后的評估標準,復發的判定標準[9]:患者出現新的神經功能缺損癥狀,經頭顱MR、CT檢查證實出現新的腦梗死病灶。無復發判定為遠期預后良好,復發判定為遠期預后不良。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白水平檢測:于溶栓前及溶栓后7 d、3個月抽取患者肘靜脈血5 ml ,采用免疫印跡法檢測Keap1、醌氧化還原酶1[NAD(P)H Quinone oxidoreductase 1,NQO1]、Nrf2、ARE蛋白相對表達量,試劑盒購自深圳市亞輝龍生物科技有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作,采用QuantityOne軟件測定灰度值,計算蛋白條帶灰度值與內條帶灰度值比值,以此表示目的蛋白相對表達量。

1.4.2 病情程度評定:采用NIHSS評分[10],其內容包括意識程度、回答問題的能力、遵從指令的能力、眼球運動、視野、面部肌力、上肢運動功能、下肢運動功能、肢體協調、感覺功能、語言、構音、感覺忽視等。評分范圍為0～42分,分數越高表示神經受損越嚴重。

2 結 果

2.1 不同近期預后組溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較 2組溶栓后7 d、溶栓后3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量高于溶栓前(P<0.01);近期預后不良組溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分高于近期預后良好組,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量低于近期預后良好組(P<0.01),見表1。

表1 不同近期預后組ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較

2.2 不同遠期預后組溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分變化比較 2組溶栓后7 d、溶栓后3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量高于溶栓前(P<0.01);遠期預后不良組溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分高于遠期預后良好組,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量低于遠期預后良好組(P<0.01),見表2。

表2 不同遠期預后組ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較

2.3 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白與NIHSS評分的關系 ACI患者溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量與NIHSS評分呈正相關(P<0.01),NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量與NIHSS評分呈負相關(P<0.01),見表3。

表3 ACI患者NIHSS評分與外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白的關系 (r/P)

2.4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對近遠期預后的預測價值

2.4.1 近期預后的預測價值:繪制溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者預測價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,溶栓后7 d的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者聯合預測近期預后不良的AUC為0.803、0.717、0.800、0.765、0.907,四者聯合優于各蛋白單獨預測價值(Z/P=2.105/0.026、2.413/0.004、2.113/0.021、2.205/0.016),見表4、圖1。

圖1 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預測ACI患者近期預后的ROC曲線

表4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者近期預后的預測價值

2.4.2 遠期預后的預測價值:繪制溶栓后3個月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者預測價值的ROC曲線,并計算AUC,結果顯示,溶栓后3個月的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者聯合預測近期預后不良的AUC為0.766、0.765、0.812、0.767、0.927,四者聯合優于各蛋白單獨預測價值(Z/P=2.238/0.010、2.241/0.008、2.115/0.019、2.231/0.012),見表5、圖2。溶栓后3個月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預測遠期預后的AUC與溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預測近期預后的AUC比較,差異無統計學意義(Z/P=0.102/0.563)。

圖2 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預測ACI患者遠期預后的ROC曲線

表5 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者遠期預后的預測價值

3 討 論

臨床普遍認為,ACI發生發展機制較為復雜,其中公認的是除了病程中腦局部缺氧缺血直接導致的神經組織損害,還會在受損腦組織缺血再灌注基礎上致使氧化應激反應被激活、氧自由基過多釋放,造成腦細胞膜脂質過氧化,從而形成微循環障礙、加劇腦細胞結構破壞,成為間接造成神經組織損害的主要原因之一[11-13]。因此,積極探索氧化應激反應相關信號通路在ACI患者中的變化成為臨床重要研究方向。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路屬于機體內重要的氧化應激信號通路,其中Keap1、Nrf2是機體氧化/抗氧化狀態的重要調節中樞因子,ARE與Nrf2具有協調效應,參與氧化應激反應發生發展過程,NQO1是受Nrf2/ARE調控的抗氧化酶,能通過催化體內多種代謝途徑達到抗氧化目的[14-15]。既往國內外均有研究證實,Keap1-Nrf2/ARE信號通路可通過調控局部腦細胞氧化應激損傷在腦血管疾病中發揮重要作用[16-17]。田琴等[18]報道表明,缺血性腦卒中患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路呈異常表達狀態,與神經損傷密切相關。本研究發現,ACI患者溶栓后近期Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量均與NIHSS評分密切相關,可見外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白水平改變與ACI患者神經功能缺損程度變化情況顯著相關,是由于機體受到氧化應激刺激會立即修飾Keap1半胱氨酸殘基,降低Nrf2穩定性,導致Keap1與Nrf2發生解離,促使Nrf2結合細胞核內的ARE,加快Nrf2/ARE之間的協調效應活化進程,調控超氧化物歧化酶、NQO1等下游基因的表達,參與神經功能損傷過程[19-21];在氧自由基大量釋放時會造成過多的Nrf2在細胞內蓄積,逐漸向細胞核內轉位,識別ARE,啟動NQO1等多種抗氧化酶表達,發揮阻礙氧自由基生成作用,從而在ACI患者神經組織損害發生及修復過程中產生相應作用[22-23]。

同時,本研究發現ACI患者溶栓后近期Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分明顯降低,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量明顯升高,其變化機制在于靜脈溶栓后ACI患者腦部微循環、神經功能得到有效修復,腦細胞氧化應激反應損傷有所減輕,促使Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白水平隨之改善,這與該信號通路參與ACI氧化應激反應、神經功能損傷修復間接影響預后改善有關。此外,本研究創新性嘗試探討外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白對ACI患者近遠期預后的預測價值,結果發現,溶栓后7 d的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白聯合預測近期預后的AUC最大,溶栓后3個月的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白聯合預測遠期預后不良的AUC最大,均優于各蛋白單獨預測,提示臨床可通過檢測外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白水平變化有效預測ACI患者近遠期預后情況,有利于及早采取針對性干預措施,降低預后不良風險。不足之處:納入樣本量偏少,可能造成數據偏倚,且未對比外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路與常規影響因素預測預后價值的優劣,今后需收集更多病例,做進一步探究與分析,以獲取更可靠的數據支持。

綜上可知,ACI患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與近遠期預后顯著相關,可作為有效預測近遠期預后情況的重要輔助途徑,能為臨床制定改善預后方案提供可靠的參考依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張歡:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;祝善堯:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;葛偉、洪斌:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉爽:進行統計學分析