鎘脅迫對(duì)泥鰍氧化毒性及肝組織損傷效應(yīng)

雷 忻，屈 蓉，杜妙柔，楊超超，譚 婷，王 琪

（延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，延安市生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000）

鎘（Cadmium，Cd）作為一種廣泛存在于水體中的重金屬污染物，具有毒性持久、難以消除的特點(diǎn)，對(duì)水生動(dòng)物具有潛在危害性［1-2］。近年來(lái)，隨著能源化工的快速發(fā)展，鎘對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響，尤其是對(duì)魚類的生存和繁殖有著顯著的影響［3-4］。延河流域作為能源化工基地重要區(qū)域重金屬鎘污染較為嚴(yán)重，對(duì)其水生生物的生理生態(tài)毒性研究較為迫切。

目前，有關(guān)Cd 對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)研究較多。例如，劉艷平等［5］通過(guò)紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)研究鎘對(duì)小鳙魚的遺傳毒性發(fā)現(xiàn)，鳙魚紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率隨水環(huán)境中Cd2+濃度升高而升高，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。賈秀英等［6］研究表明，高濃度組鎘對(duì)兩棲類黑斑蛙肝臟指數(shù)呈逐漸減少的趨勢(shì)，肝組織、腎組織、心臟組織Na+-K+-ATPase 隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，表明Cd 對(duì)黑斑蛙作用是明顯的時(shí)間、劑量-效應(yīng)關(guān)系。雷忻等［7］研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+濃度的升高、染毒時(shí)間延長(zhǎng)，雄性泥鰍肝臟Vtg 呈升高的趨勢(shì)，同時(shí)也表現(xiàn)了環(huán)境雌激素效應(yīng)。關(guān)于Cd 對(duì)泥鰍的氧化毒性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)報(bào)道得較少，有關(guān)Cd脅迫下泥鰍抗氧化機(jī)制響應(yīng)研究對(duì)進(jìn)一步探究環(huán)境污染物對(duì)魚類代謝毒性、生殖毒性具有一定的參考意義。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）是兩種重要的與氧化作用相關(guān)的酶。SOD 具有抗氧化和氧化平衡的功能，與很多疾病的產(chǎn)生有密切的關(guān)系［8］。SOD 存在于細(xì)胞質(zhì)中，其作用將超氧陰離子（O2-）變成H2O2和O2；CAT 是一種主要的酶類清除劑，主要存在于紅細(xì)胞和一些組織中，它是一種以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，可將產(chǎn)生的H2O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，發(fā)揮機(jī)體抗氧化作用。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、泥鰍屬（Misgunus），是一類小型硬骨淡水魚，是一種重要的水環(huán)境監(jiān)測(cè)的水生生物，分布范圍廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)室條件下易于馴養(yǎng)，適合作為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［9-10］。本研究以泥鰍為研究對(duì)象，采用靜水養(yǎng)殖法、鄰苯三酚自氧化法、鉬酸銨比色法檢測(cè)Cd對(duì)泥鰍肝臟SOD和CAT活性的影響，并采用H·E染色法觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，為了解Cd對(duì)泥鰍的氧化毒性提供一定的參考依據(jù)，同時(shí)為推進(jìn)延安地區(qū)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，控制環(huán)境污染，保持生態(tài)平衡，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用泥鰍平均體重11.86±3.0 g，平均體長(zhǎng)11.8±2.5 cm。均由陜西省延安市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供。將泥鰍在自然脫氯96 h 的自來(lái)水中馴養(yǎng)7 d，挑取體格強(qiáng)健活躍的泥鰍為研究對(duì)象。

采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法對(duì)泥鰍染毒［11］，按照《國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（Cd2+濃度＜0.005 mg/L），參照文獻(xiàn)［11-14］設(shè)置4 個(gè)濃度梯度0.005、0.050、0.500、5.000 mg/L 和1 個(gè)曝氣自來(lái)水對(duì)照組，每組隨機(jī)投放25條泥鰍，試驗(yàn)過(guò)程中每天更換受試藥液。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與主要儀器

氯化鎘（西安化學(xué)試劑廠）、鉬酸銨（天津市凱達(dá)化工廠）、焦性沒(méi)食子酸、伊紅和蘇木色精（天津博迪化工股份有限公司）。所有試劑均為分析純。UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津企業(yè)管理公司）、輪式切片機(jī)（德國(guó)）和Leica 正置光學(xué)顯微鏡DM6B。

1.3 抗氧化酶活性檢測(cè)

同上取樣，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，用濾紙擦拭干燥表面，快速準(zhǔn)確計(jì)量，加入用6.7 mmol/L磷酸鹽緩沖液，冰浴中研磨成漿，以3 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液放置于冰箱中，采用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)SOD 活性［15］，采用鉬酸銨比色法檢測(cè)CAT活性［16］。

1.4 肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察

同上取樣，放入Bouin’s 固定液中將其固定24 h，沖洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片、染色，中性樹(shù)脂封片，鏡檢、觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件（版本v26.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Origin軟件制圖，以及Microsoft Excel 2003處理以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，分析各濃度處理組與對(duì)照組的差異顯著性。其中，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟SOD活性的變化

由圖1 可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，雌性泥鰍在Cd 暴露下處理10 d，肝臟SOD 活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在最高濃度組（5.000 mg/L）極顯著升高（P＜0.01），并達(dá)到最大值；Cd 暴露20 d 時(shí)，0.050 mg/L 濃度組肝臟SOD 活性顯著升高（P＜0.01），之后呈下降再升高的U形趨勢(shì)；Cd暴露30 d時(shí)，0.005 mg/L濃度組SOD活性就極顯著升高（P＜0.01），并達(dá)到最大值，之后呈下降再升高的U 形趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，雄性泥鰍在暴露10、20、30 d 時(shí)，最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）SOD 活性均極顯著升高（P＜0.01），之后隨濃度增大，活性基本呈下降趨勢(shì)；Cd暴露30 d時(shí)，SOD 活性在各濃度組均極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖1 重金屬Cd對(duì)泥鰍肝臟SOD活性的影響

2.2 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟CAT活性的變化

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，0.005、0.050 mg/L Cd濃度組在暴露第10 d 時(shí)，雌性泥鰍肝臟CAT 活性極顯著升高（P＜0.01），之后隨濃度繼續(xù)增大而活性下降，5.000 mg/L 濃度組CAT 活性極顯著降低（P＜0.01）；Cd暴露20 d時(shí)，各濃度組泥鰍肝臟CAT活性均極顯著升高（P＜0.01），并隨著濃度增大呈先升高后下降趨勢(shì)；Cd 暴露30 d 時(shí)，0.050、0.500 mg/L 濃度組CAT 活性極顯著升高（P＜0.01），但5.000 mg/L濃度組活性極顯著降低（P＜0.01）；Cd 暴露10、20、30 d，0.050 mg/L 濃度組雌性泥鰍CAT 活性均達(dá)到最大值，之后隨濃度增大均呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，雄性泥鰍在Cd 低濃度組（0.005 mg/L）暴露10、20、30 d，CAT活性均顯著升高（P＜0.05）；Cd暴露20 d時(shí)，高濃度組（5.000 mg/L）CAT活性下降及其顯著；雌、雄性泥鰍在相同暴露時(shí)間，CAT 活性均隨Cd濃度增大，呈現(xiàn)升高后下降的趨勢(shì)。

圖2 重金屬Cd對(duì)泥鰍肝臟CAT活性的影響

2.3 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟的組織學(xué)變化

由圖3 可以看出，空白對(duì)照組中，雌性、雄性泥鰍的肝臟細(xì)胞分布比較均勻，細(xì)胞核均在細(xì)胞中央，為圓形或者橢圓狀（圖3A、E）。與對(duì)照組比較，在低濃度0.050 mg/L Cd 中暴露30 d 后，肝組織間隙增大、空泡化（圖3B、F）；隨著濃度增加，雌性、雄性泥鰍肝組織中的細(xì)胞間隙進(jìn)一步加大，同時(shí)發(fā)生嚴(yán)重的肝細(xì)胞腫大、空泡化、核溶解現(xiàn)象。在同一濃 度下，雄性損傷要比雌性損傷結(jié)果更加明顯。

圖3 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)變化

3 討論

3.1 Cd對(duì)雌、雄性泥鰍氧化毒性效應(yīng)

SOD 和CAT 是水生動(dòng)物抗氧化酶系的重要成分，它們的變化可反映外源污染物對(duì)動(dòng)物的氧化毒性效應(yīng)。宋志慧等［17］發(fā)現(xiàn)低濃度氧化樂(lè)果會(huì)激活椎實(shí)螺體內(nèi)酶活響應(yīng)機(jī)制，導(dǎo)致CAT 活性升高；高濃度氧化樂(lè)果會(huì)損傷靜水椎實(shí)螺抗氧化系統(tǒng)，使得CAT 活性降低。張楠等［15］通過(guò)研究Zn2+對(duì)大型溞（Daphniamagna）生理毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨Zn2+的濃度升高，大型溞SOD 和CAT 活性基本呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的規(guī)律。賈秀英等［16］對(duì)鯽魚的研究也顯示在低濃度的Cu2+、Cd2+的脅迫下，肝組織SOD 酶活性升高，隨著Cu2+、Cd2+濃度的增大，酶活性又呈明顯下降趨勢(shì)。孫淑紅等［18］研究表明低濃度Cd 脅迫下，泥鰍肝組織中SOD 活性即可被顯著誘導(dǎo)。本研究中，雌性泥鰍在Cd暴露10 d時(shí)肝臟SOD 活性在最高濃度組（5.000 mg/L）表現(xiàn)為極顯著升高，而在暴露30 d時(shí)，最低Cd濃度組（0.005 mg/L）SOD 活性就升高極其顯著，并在相同時(shí)間，SOD活性呈下降再升高的U 形趨勢(shì)，表明了雌性泥鰍肝臟組織在Cd暴露達(dá)到一定時(shí)間和劑量時(shí)，才顯著誘導(dǎo)SOD 活性，產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化毒性效應(yīng)。而雄性泥鰍在Cd 暴露10 d 時(shí)，最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）SOD活性就升高極其顯著，并在相同暴露時(shí)間，SOD活性隨著Cd濃度增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，提示低濃度Cd 即可對(duì)雄性泥鰍SOD 活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，表現(xiàn)出明顯的氧化毒性效應(yīng)。因此，Cd 對(duì)雄性泥鰍SOD 活性誘導(dǎo)作用較雌性泥鰍強(qiáng)。雌性泥鰍在最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）暴露10 d 時(shí)，肝臟CAT 活性升高就極其顯著，在0.050 mg/L 濃度組暴露10 d、20 d、30 d 時(shí)，CAT 活性均達(dá)到最大值，之后隨濃度增大均呈下降趨勢(shì)。Cd 暴露中的雄性泥鰍CAT 活性變化趨勢(shì)類似雌魚，但變化程度不及雌魚劇烈。泥鰍在Cd 脅迫下產(chǎn)生了大量的O2-，為了保護(hù)機(jī)體清除多的自由基，肝臟SOD 和CAT 的活性被大量激活，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，Cd在體內(nèi)大量富集，對(duì)抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，又會(huì)抑制兩種酶活性，因此具有一定的劑量-效應(yīng)與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

3.2 Cd對(duì)雌、雄性泥鰍肝組織損傷效應(yīng)

肝臟是魚體內(nèi)重要的解毒器官，當(dāng)有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)對(duì)肝組織結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷［19］。沈文靜等［20］研究表明斑馬魚短期接觸敵草快后，肝細(xì)胞發(fā)生了腫脹、空泡，隨著敵草快濃度的升高，肝組織的損害更加嚴(yán)重，肝細(xì)胞發(fā)生明顯壞死，導(dǎo)致動(dòng)物肝功能喪失而死亡。王文龍等［21］對(duì)吉富羅非魚幼魚的研究表明，銅可使肝臟表現(xiàn)出不同程度病變，隨著銅濃度的增加，肝臟被誘導(dǎo)致濁腫變性和脂肪變性。王利等［22］觀察到銅暴露下鯉魚肝細(xì)胞有空泡變形、腫大、細(xì)胞核溶解的現(xiàn)象。本研究中，隨著Cd濃度增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，雌、雄性泥鰍肝細(xì)胞都出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞腫大、核溶解、變形等組織結(jié)構(gòu)異常，說(shuō)明Cd可對(duì)泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)，并且對(duì)雄性損傷要比雌性損傷更為嚴(yán)重。

4 結(jié)論

1）一定劑量Cd 對(duì)泥鰍肝臟SOD 活性有明顯誘導(dǎo)作用，其中對(duì)雄性的誘導(dǎo)作用較雌性強(qiáng)烈；一定劑量Cd 對(duì)泥鰍肝臟CAT 活性也有明顯誘導(dǎo)作用，其中對(duì)雌性的誘導(dǎo)作用較雄性強(qiáng)烈。因此，Cd 對(duì)雌、雄性泥鰍均可產(chǎn)生明顯的氧化毒性效應(yīng)。

2）一定劑量Cd 脅迫可對(duì)泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)，其中對(duì)雄性損傷要比雌性損傷更為嚴(yán)重。