不同造模周期下云南春燥環境小鼠模型的比較研究*

張子龍 柏靜萍 潘賜明 楊 梅 魏寧頤

云南中醫藥大學,云南省昆明市 650500

目前,云南春燥動物模型研究方面取得了較大的成效。本課題組前期采用病因造模方法初步構建了云南春燥小鼠動物模型。基本確定了病因造模條件(溫度、濕度、風速、光照及飲食)以及評價指標[1],但尚未對感燥時間長短對燥證發病的影響進行證實,本研究的目的是在前期研究基礎上采用不同造模周期下的小鼠模型進行研究,以期探索感燥時間長短與燥證發病的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 MUC5ac ELISA試劑盒(南京草本源);AQP5 ELISA試劑盒(南京草本源);Mouse IgG ELISA試劑盒(杭州聯科);Mouse IgA ELISA試劑盒(杭州聯科);生理鹽水(昆明南疆);75%乙醇消毒液(昆明倍健生物)。

1.2 實驗儀器 酶標儀Spectra Max(美國MD);高速冷凍離心機(美國Thermofisher);-80℃超低溫冰箱(美國Thermofisher);超凈工作臺(北京半導體設備);移液器(力辰邦西儀器);一次性使用手術單(衡水安幫醫療);一次性無菌注射器(江蘇治宇醫療);外科手術剪(湖南可孚醫療);止血鑷(湖南可孚醫療)。

1.3 實驗動物 SPF雄性KM小鼠90只,體重為(20±2)g/只。由昆明醫科大學實驗動物中心提供;生產準許證編號:SYXK(滇)K2017-0005;飼養于云南中醫藥大學動物實驗中心。

1.4 檢測指標 小鼠氣道MUC5ac、AQP5及血清IgA、IgG。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組:小鼠適應性飼養3d后,隨機分為正常組和模型組,在此基礎上再分別設置7d、14d、21d正常組及模型組共6組,每組15只。

1.5.2 各組小鼠飼喂及環境干預條件設置:各組小鼠在經過適應性飼喂后,置于動物培養箱中。飼喂及環境干預條件設置如表1所示。

表1 各組小鼠飼喂及環境干預條件設置

1.5.3 小鼠血清樣本、BALF的采集:7d組小鼠在實驗周期第7天20:00禁食禁水,于次日進行取材,14d組、21d組分別在相應周期的最后1d禁食禁水,于后1d取材;采用眼球摘除法取血:事先準備離心管,固定于操作臺上,左手抓取小鼠,暴露其頭面部,手術剪剪掉胡須,酒精擦拭消毒,避免污染及溶血,食指沿小鼠背部向后向下捻動,使小鼠左側眼部皮膚伸展,左側眼球充血突出,使小鼠頭部向下,用彎頭鑷夾取眼球并摘除,血液垂直滴入離心管內,取血約1ml,將離心管于室溫(約25℃)下靜置2h,采集的全血做離心(3 000r/min、4℃、15min)處理,取上清液,采用ELISA法檢測小鼠IgA、IgG含量;取血后將小鼠固定于超凈臺上,使用滅菌手術剪及鑷子解剖小鼠頸部組織,使其氣管暴露完全,鈍性分離覆于氣管上的組織、血管;沿正中線上距喉頭約0.5cm下方處剪一小口,用安裝上8號灌胃針的無菌注射器平行插入氣管內并固定,緩緩向肺內推注37℃的生理鹽水1ml,回抽此液,該動作重復2次即可[2];將取得的灌洗液離心(參數:2 500r/min、4℃、20min),取上清液,采用ELISA方法檢測小鼠氣道黏蛋白MUC5ac、水通道蛋白AQP5。

2 結果

2.1 小鼠氣道MUC5ac、AQP5 7d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,但差異無統計學意義(P>0.05);14d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,差異具有統計學意義(P<0.05);21d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,差異無統計學意義(P>0.05)。7d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度升高,但差異不具統計學意義(P>0.05);14d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度降低,差異具有統計學意義(P<0.05);21d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度降低,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠氣道MUC5ac、AQP-5濃度比較

2.2 小鼠血清IgA、IgG 與同周期組正常小鼠比較,7d組模型小鼠血清IgA濃度降低,差異具有統計學意義(P<0.05),血清IgG濃度升高,極具統計學差異(P<0.01);14d組模型小鼠血清IgA濃度降低,極具統計學差異性(P<0.01),血清IgG濃度升高,極具統計學差異性(P<0.01);21d組模型小鼠血清IgA濃度升高,但差異無統計學意義(P>0.05);21d組模型小鼠血清IgG濃度升高,極具統計學差異(P<0.01),見表3。

表3 各組小鼠血清IgA、IgG濃度比較

3 討論

3.1 不同實驗周期小鼠氣道黏蛋白MUC5ac、水通道蛋白AQP-5的變化 氣道黏蛋白MUC5ac在氣管、支氣管中分布較多,是由上皮細胞—杯狀細胞分泌產生的一種大分子糖蛋白[3],黏蛋白是黏液的主要成分[4],多項研究表明[5-7]MUC5AC分泌增加會導致氣道黏液高分泌,產生黏痰與氣道炎癥,反之則會導致氣道黏液分泌減少,使氣道出現干燥改變;而水通道蛋白AQP-5對于調節汗腺、眼睛、肺和腎臟中的水穩態至關重要[8],作為氣道上水分子轉運的主要通路,可以調整氣道內的水液量,以維持氣道內相對適宜的環境[9],AQP-5含量降低會導致肺阻力增加和氣道高反應性[10],從而對氣管和肺組織產生損傷,同時減少氣道水液量,造成局部干燥表現。因此MUC5ac、AQP-5的含量降低程度與機體津液虧損密切相關。

本實驗結果顯示,在第7、14、21天MUC5ac、AQP-5含量較正常組均有降低,且均以14d組的變化最顯著,而21d組較14d組略有回升。二者含量于本實驗中降低,說明春燥環境下的小鼠體內存在著津液損傷的病機。燥邪對小鼠氣道的損傷于14d最重。津液損耗加之氣道受邪,其黏膜的結構、功能損傷,津液的生成與輸布失常,可見小鼠MUC5ac、AQP5濃度降低。實驗中隨著飼喂時間的延長,小鼠逐漸適應云南春燥環境,體內津液重新分布,燥證得到一定程度的緩解。與前期臨床研究得出的,初入云南比久居云南的人群感燥更加明顯的結果相符。

3.2 不同實驗周期小鼠IgA、IgG的變化 IgA是血清中占比第二的免疫球蛋白,其中IgA又分為分泌型sIgA及血清型IgA,sIgA主要由呼吸道等黏膜細胞合成,IgA主要由腸系膜細胞合成,血清IgA具有某些與IgG相類似的免疫功能[11],可參與機體大部分特異性免疫,有研究表明,人血清IgA的升高與肺功能呈明顯相關性[12]。IgG是血漿中最豐富的抗體,是體液免疫反應的關鍵蛋白,通過其多重作用將先天免疫和適應性免疫聯系起來[13],其主要存在于終末細支氣管以下的氣道內,是呼吸道體液免疫中的重要免疫球蛋白。IgG一部分由局部合成,一部分由血清滲出到呼吸道中,尤其當細菌進入黏膜引起炎癥反應或過敏反應時可增加IgG由血清滲出,且相較于其他部位,IgG表現出對肺部感染的高活性[14],其在體內的分布和參與免疫應答的范圍廣,對判斷機體抗感染能力及感染后的免疫強度有著重要的參考價值。IgA、IgG在呼吸系統免疫防御方面發揮著重要的作用,與中醫的肺氣衛外功能有著密切的相關性[15]。動物模型氣道內分泌型免疫球蛋白sIgA及免疫球蛋白IgG在呼吸系統疾病中與機體免疫防御功能的強弱存在相關性[16],一定程度上反映了云南春燥環境小鼠肺衛外功能的變化[17]。即IgA、IgG濃度發生變化,說明機體呼吸系統、免疫系統對外環境產生了應答,也相當于中醫邪正相爭,衛氣抗邪活動的表現。

本實驗結果顯示,模型組小鼠的IgA、IgG濃度均發生變化,說明春燥環境中的小鼠感受了燥邪并作出防御反應。與正常組相比,7d、14d組模型小鼠血清IgA濃度降低明顯,以14d組模型小鼠降低顯著,21d組小鼠血清IgA濃度略高于同周期正常組,但差別不大。考慮初感春燥小鼠,正氣充足,肺衛功能損傷較小,故機體能夠快速作出防御驅邪反應,小鼠血清IgA感應春燥邪氣較為敏銳,以第14天最為明顯,隨著感燥時間持續延長至21d,模型小鼠對于春燥環境有適應性改變,故血清IgA濃度回升,略高于正常且趨近于正常;3組小鼠血清IgG濃度均明顯升高,以21d模型組小鼠血清IgG濃度升高最顯著,綜合小鼠MUC5ac、AQP5含量降低的狀況進行分析,筆者認為,小鼠在云南春燥環境下,感受了燥邪,肺系以氣道與外界自然直接連接,燥邪從氣道入而傷肺,肺衛作為防御機體受邪的第一道防線,外燥從外入里侵襲必首先與肺衛相爭。小鼠則見燥傷津液與衛氣失宣,衛外失職共見之表現。這與中醫“燥勝則干”“燥邪犯傷人,首先犯肺”的病因病機理論相契合。

總之,不同周期模型小鼠在MUC5ac、AQP5、IgG、IgA均出現了改變,且以14d尤為顯著,故說明14d周期可以作為云南春燥小鼠動物模型最佳造模周期予以進一步研究。