胃癌中COL1A2表達及其與免疫細胞浸潤關系的研究*

陳 乾 付 琦 王天明 李曉麗 陳全鑫 吳志航 潘海邦

甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院,甘肅省蘭州市 730000

胃癌是世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一,其死亡率和發病率均居惡性腫瘤的前五位[1-2]。近年來,胃癌的診療水平已有了很大的提高,但因其起病較隱匿,早期無癥狀或癥狀不明顯,早期易漏診,多數患者診斷時已是臨床晚期或已發生遠處轉移[3]。傳統的血清腫瘤標志物對胃癌診斷有一定指導意義,但靈敏度及特異度均不佳,因此尋找特異性強和靈敏性較高的生物標志物用于胃癌早期診斷、指導治療和判斷預后顯得尤為重要。

Ⅰ型膠原蛋白是膠原蛋白家族中的一個重要成員,其中Ⅰ型膠原α2鏈(COL1A2)被認為影響腫瘤的侵襲和進展,是細胞外間質的關鍵結構成分。COL1A2具有多種生物學功能,近年來發現可在肺癌、胰腺癌等多種組織呈高表達狀態,并且可以允許癌細胞侵襲和遷移[4-5]。但關于COL1A2在胃癌中的研究相對較少,因此,本研究通過生物信息學分析,探討COL1A2在胃癌組織中的表達水平及其與免疫細胞浸潤的關系,為胃癌的臨床診治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 資料來源 COL1A2的數據來源于TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)。TIMER數據庫(http://timer.cistrome.org/)是用于系統分析各種癌癥類型的免疫浸潤的綜合數據庫。Kaplan-Meier plotter數據庫(https://kmplot.com/analysis/)收錄了肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌的生存信息,可以用來評估基因對患者生存率的影響。

1.2 COL1A2表達水平分析 通過TIMER數據庫分析不同腫瘤與鄰近正常組織中COL1A2的基因表達。從TCGA數據庫下載胃癌基因表達數據共407例,其中包含胃癌組織375例、正常胃組織32例。使用R軟件中的“limma”包對胃癌基因表達數據及臨床數據進行分析和整理。

1.3 COL1A2預后的相關性分析 將COL1A2輸入Kaplan-Meier plotter數據庫中,得到K-M生存曲線,比較COL1A2不同表達水平患者的總生存期(OS)、首次進展生存期(FP) 和再次進展生存期(PPS)。基于TCGA數據庫通過R軟件中“timeROC”“survival”“regplot”包繪制胃癌患者預后發生風險的列線圖模型,并作受試者工作特征曲線(ROC),計算曲線下面積(AUC),繪制校準曲線檢驗評估列線圖模型準確度;采用單因素Cox回歸分析COL1A2在胃癌預后中的評估價值。

1.4 COL1A2單基因GSEA分析 根據TCGA-STAD數據集中COL1A2表達量的中位值,將基因表達數據分為高、低表達組。應用R軟件中“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”包對COL1A2進行信號通路富集分析,以|NES|≥1.0、NOM p-val<0．05、FDR q-val<0．25為條件對COL1A2單基因富集結果進行篩選。

1.5 免疫細胞浸潤分布特點 根據TCGA-STAD數據集,使用R軟件中的“CIBERSORT”包分析22種免疫細胞與胃癌中COL1A2的關系,并揭示免疫細胞浸潤之間的關聯性,使用“vioplot”包進行預后模型可視化。

1.6 統計學方法 采用R軟件對數據進行處理與分析。應用Wilcoxon檢驗分析COL1A2在胃癌組織與正常組織之間的表達差異;應用Kruskal檢驗分析COL1A2表達與臨床病理參數間的相關性;應Kaplan-Meier分析COL1A2高、低表達組之間生存率的差異;應用單因素Cox回歸模型分析COL1A2在胃癌患者中的預后意義;使用Spearson函數分析COL1A2與免疫細胞浸潤之間的相關性,P<0．05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 COL1A2在胃癌組織中的表達水平 通過TIMER數據庫分析COL1A2在不同腫瘤組織中的表達,結果提示COL1A2在胃癌組織中表達顯著高于正常組織。TCGA-STAD數據集分析顯示胃癌組織中COL1A2的表達量高于正常組織(P<0.001,見圖1a);對TCGA-STAD數據集中胃癌組織及相對應正常組織的分析結果表明,COL1A2在胃癌組織中的表達高于配對正常組織(P<0.001,見圖1b)。

a b

腫瘤組織及相對應正常組織中COL1A2的表達;*P<0.001

2.2 COL1A2的表達與臨床病理參數的關系 TCGA-STAD數據集的分析結果表明。COL1A2基因表達與T分期、臨床分期和組織學分級具有相關性。COL1A2表達水平在T1與T2、T3、T4具有相關性,臨床分期Stage1和Stage2、Stage3具有相關性,組織學分級Grade2和Grade3具有相關性,差異有統計學意義(P<0．05),見圖2。

圖2 COL1A2表達量與胃癌患者臨床病理特征相關性

2.3 COL1A2基因與胃癌患者預后的關系 運用Kaplan-Meier plotter繪制COL1A2基因與胃癌患者預后的生存曲線(見圖3)。結果顯示COL1A2基因高表達與胃癌患者更短的總生存期(OS) (HR=1.58,95%CI:1.33～1.87,Log-rankP<0．001)、首次進展生存期(FP) (HR=1.61,95%CI:1.31～1.97,Log-rankP<0．001)及再次進展生存期(PPS) (HR=1.46,95%CI:11.15～1.85,Log-rankP=0.0017)顯著相關。

圖3 不同COL1A2基因表達水平胃癌患者的生存曲線

2.4 COL1A2表達水平列線圖的構建和驗證 根據

篩選的變量構建了列線圖來評估胃癌患者的預后。將性別、年齡、T分期、M分期、N分期、臨床分期、組織學分級7個獨立預后相關因素納入構建列線圖,得到胃癌患者1、3、5年總生存率的列線圖。總得分是根據使用列線圖模型計算的單個因素得分確定的;本研究中的大多數患者的總危險得分為370～520。COL1A2表達水平預測胃癌1年不良預后的AUC為0.561;預測3年不良預后的AUC為0.577;預測5年不良預后的AUC為0.726,>0.7對于患者的預后評估有參考價值。列線圖的校準曲線分析表明,該列線圖預測的1、3、5年總生存率與實際生存率之間具有良好的一致性,見圖4。

2.5 COL1A2與臨床特征單因素Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析結果顯示,年齡(HR=1.026,P=0.004)、腫瘤分期(HR=1.534,P<0.001)和COL1A2(HR=1.172,P=0.016)可有效預測胃癌患者的生存,見表1。

表1 COL1A2與臨床特征單因素Cox回歸分析

2.6 COL1A2基因的GSEA富集分析 GSEA結果根據校正后的富集得分(NES)選擇了最顯著的信號通路(FDR<0.05,P<0.05)。篩選出COL1A2高表達樣本主要富集于軸突引導通路、細胞黏附分子通路、細胞外基質受體相互作用通路、TGF-β信號通路。低表達樣本主要富集在嗅覺轉導通路,見表2。

表2 COL1A2功能富集分析

2.7 COL1A2表達與免疫細胞浸潤 以COL1A2表達的中位值,將375例腫瘤樣品分為高、低表達兩組,通過CIBESORT算法評估樣本中22種免疫細胞表達水平的差異(見圖5)。B細胞、漿細胞、巨噬細胞,肥大細胞和中性粒細胞是受COL1A2影響的主要細胞,其中低表達組的幼稚B細胞、記憶B細胞、漿細胞增加(P<0.05),而M2巨噬細胞、活化的肥大細胞和中性粒細胞減少(P<0.05)。M2巨噬細胞、M0巨噬細胞、γδT細胞和中性粒細胞和COL1A2正相關,幼稚B細胞、漿細胞和記憶性B細胞和COL1A2負相關。

圖5 22種免疫細胞在胃癌及正常組織中的表達差異

3 討論

胃癌的發生機制復雜,是多種危險因素和保護因素相互作用的結果。胃癌的治療關鍵在于早期確診以便于患者進行有效的治療,但大部分胃癌患者都在晚期被確診。因此,探索胃癌可能的致病機制以及尋找胃癌發生發展中的分子標志物對于胃癌的診斷和治療具有重要意義。

COL1A2是編碼Ⅰ型膠原α2鏈的重要基因。COL1A2具有多種生物學功能,異常表達的甲基化的COL1A2可以引起機體內環境的改變,從而參與多種疾病的發生發展,研究人員發現COL1A2基因在大腸癌組織中高甲基化,其mRNA表達明顯降低,而COL1A2 mRNA在髓母細胞瘤中表達上調[6]。COL1A2在膀胱癌、食管癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中也明顯增加[7-9]。

在本研究中,通過TIMER數據庫和TCGA數據庫發現COL1A2在胃癌中的表達水平高于正常組織。進一步分析顯示,COL1A2與T分期、臨床分期和組織學分級相關,并且COL1A2高表達提示胃癌患者預后不良。此外,通過K-M分析發現COL1A2高表達與胃癌患者更短的總生存期、首次進展生存期及再次進展生存期顯著相關。本研究所建立的列線圖模型表明COL1A2能有效預測胃癌患者預后,基于該列線圖模型預測高危患者具有一定臨床價值。單因素Cox分析顯示,COL1A2可有效預測胃癌患者的生存。為深入研究COL1A2在胃癌發生發展中的生物學功能及分子調控機制,本文對COL1A2進行GSEA富集分析,結果顯示COL1A2高表達樣本主要富集在軸突引導通路、細胞黏附分子通路、細胞外基質受體相互作用通路、TGF-β信號通路。已有研究表明軸突引導通路在乳腺癌轉移過程中起重要作用,并在胰腺癌中起作用細胞黏附分子通路主要涉及黑色素瘤的傳播、與微環境的相互作用和轉移[10]。Bao等[11]發現細胞外基質受體相互作用通路可能參與乳腺癌的發生與發展。Colak 等[12]強調TGF-β信號通路可以促進腫瘤的發生、轉移和耐藥。上述證據表面COL1A2可以通過這些過程和途徑對人體起作用,本研究結果有助于增進對COL1A2生物學功能的理解。

本研究進一步探索了COL1A2基因表達與胃癌免疫微環境的關系,結果顯示COL1A2基因與多種免疫細胞浸潤水平相關。我們發現在胃癌中,B細胞、漿細胞、巨噬細胞,肥大細胞和中性粒細胞是受COL1A2表達影響的主要細胞。M2巨噬細胞、M0巨噬細胞、γδT細胞和中性粒細胞和COL1A2正相關,幼稚B細胞、漿細胞和記憶性B細胞和COL1A2負相關。巨噬細胞是浸入腫瘤組織中主要的炎癥細胞,其釋放大量的炎癥介質,創造炎癥環境,促進腫瘤生長并降低抗腫瘤免疫力。既往研究發現中性粒細胞、B細胞、T細胞浸潤與胃癌的預后不良相關[13]。本研究提示COL1A2可能通過影響這些免疫細胞的浸潤而調控胃癌的進展,但這仍需要更多的動物實驗及臨床試驗驗證。

綜上所述,COL1A2在胃癌組織中高表達,可調節胃癌發展過程中的免疫浸潤細胞水平,并與胃癌的預后不良有關。因此,COL1A2可作為胃癌的獨立預后因子,并有望為胃癌診斷和治療策略提供一定價值。