產胞外多糖酵母菌的篩選鑒定及發酵條件優化

劉麗娜,杜仁鵬,2,徐家菊,趙 丹,2,3

(1.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室,哈爾濱 150080;2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心,哈爾濱 150500;3.廣西民族大學 海洋與生物技術學院 廣西多糖材料與改性重點實驗室,南寧 530008)

0 引 言

酵母菌在自然界中分布廣泛,成員眾多,是人類生活中的第一類“家養微生物”,在食品和飲料發酵過程中起著重要作用[1]。酵母菌在發酵過程中能夠分泌一種高分子聚合物到細胞外,該物質稱為胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)。酵母菌EPS具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、增強機體免疫力和降膽固醇等作用,還可用作生物粘合劑、絮凝劑、吸附劑、膠凝劑、穩定劑和增稠劑,廣泛應用于食品、化妝品和制藥工業[2-4]。產EPS的酵母菌有畢赤酵母屬(Cryptococcus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、酵母菌屬(Saccharomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)等[5]。相比乳酸菌EPS,酵母菌EPS雖然產量較低,但其更易于分離,粘度較低,穩定性高[6]。而且,酵母菌的很多成員是生物安全性菌株[7],表現出良好的膽鹽和pH耐受能力,具有益生潛力[8]。因此,挖掘生物安全性高且高產EPS的酵母菌菌株,是目前微生物EPS領域的研究熱點之一。

酵母菌EPS的產生與次生代謝有關,生物合成取決于許多因素,包括培養基的組成和發酵條件,如pH、溫度和氧氣濃度等[9]。Gientka等采用單因素試驗對假絲酵母(Candida)產EPS的碳源進行優化,EPS產量從4.43 g·L-1增加到7.80 g·L-1[10]。包怡紅等從自然界中分離出一株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis),經單因素和響應面試驗優化后,EPS產量提高了79.9%[11]。此外,益生菌EPS可作為益生元提高菌株在胃腸道中的定植能力。因此,菌株必須具有良好的pH和膽鹽耐受能力,才能在體內發揮益生作用。Yildiran等從水果和蔬菜以及乳制品中分離出134株酵母菌,其中S.cerevisiae具有良好的pH和膽鹽耐受能力,且產EPS含量最高[12]。挖掘EPS初始產量高、體內環境耐受能力強的酵母菌株,并優化EPS生物合成條件,是酵母菌EPS工業化應用的重要任務。

本文從實驗室保藏的10株酵母菌中,利用平板初篩和搖瓶發酵復篩獲得1株高產EPS酵母菌,通過形態觀察、生理生化鑒定以及18S rDNA序列分析鑒定,探究菌株Y3的pH和膽鹽耐受能力,并通過單因素試驗優化產EPS的培養基成分和培養條件。研究結果為酵母菌EPS工業生產提供了技術支持,為開發功能性酵母菌EPS食品奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及培養基

供試菌株保藏于黑龍江大學普通高等學校微生物重點實驗室。

酵母浸出粉胨葡萄糖(Yesat extract peptone dextrose,YPD)培養基：葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,蒸餾水1 L;pH自然,108 ℃滅菌20 min,用于酵母菌的活化和保藏。

基礎產糖培養基：葡萄糖10 g,蔗糖65 g,酵母浸粉2 g,硫酸銨2 g,氯化鈣0.1 g,蒸餾水1 L;pH 6,108 ℃滅菌20 min,用于酵母菌產EPS。

1.1.2 主要藥品、試劑和試劑盒

酵母菌API 20C試劑條(REF20210)購自生物梅里埃法國股份有限公司。酵母菌基因組DNA提取試劑盒(DP307-02)、DL2000購自天根生化科技(北京)有限公司。膽鹽購自上海瑞永生物科技有限公司。苯酚、無水乙醇等常規生化試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 產EPS酵母菌的初篩

利用YPD培養基將10株酵母菌進行活化,將活化的菌液分別三區劃線于YPD和基礎產糖瓊脂培養基,30 ℃培養箱培養2 d,根據菌株在兩種培養基上的菌落形態篩選產EPS菌株。

1.2.2 高產EPS酵母菌的復篩

將產EPS菌株按1%(V/V)的接種量轉接到基礎產糖液體培養基中,30 ℃、150 r·min-1培養140 h。發酵液12 000 r·min-1離心10 min,去除菌體,收集上清液。取1 mL上清液適當稀釋,取稀釋液,采用苯酚-硫酸法測定EPS產量[13],以葡萄糖為標準制作標準曲線[14],計算EPS含量。

1.2.3 高產EPS菌株鑒定

1.2.3.1 菌落和菌體形態觀察

將產EPS菌株在YPD和基礎產糖瓊脂培養基上三區劃線,培養24 h,觀察培養基上的菌落狀態。取菌體,根據Prasanna等的方法[15]制備樣品,使用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)(S-4800,Hitachi,Japan)觀察產EPS菌株顯微形態。

1.2.3.2 生理生化鑒定

按Schuffenecker[16]的方法,使用API 20C試劑條測定菌株對19種碳水化合物的發酵情況。將菌液在YPD瓊脂培養基上三區劃線,挑取培養24～48 h的新鮮菌落溶于0.85%(m/V)氯化鈉溶液中,制備標準麥氏比濁度為2(OD550=0.5)的菌懸液。取100 μL菌懸液加入到API 20C培養基的安瓿瓶中混勻,將培養液轉入杯中,30 ℃培養48 h或72 h后觀察結果,參照分析圖譜索引或鑒定軟件鑒定菌株生理生化特性。

1.2.3.3 18S rDNA序列分析

將產EPS菌株按1%(V/V)接種量轉接到YPD培養基,30 ℃培養12 h。用酵母基因組DNA提取試劑盒進行總DNA提取,以上游引物5′GTAGT CATAT GCTTG TCTC 3′和下游引物5′ GCATC ACAGA CCTGT TATTG CCTC 3′進行PCR擴增[17]。PCR擴增程序：98 ℃預變性2 min,循環次數1次;98 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃再延伸2 min[18]。將PCR產物測序結果與NCBI數據庫進行比對并提交,構建系統發育樹。

1.2.4 菌株的生物學特性

1.2.4.1 菌株的pH耐受性

將產EPS菌株種子液以2%(V/V)接種量接入100 mL/250 mL YPD培養基,30 ℃ 150 r·min-1振蕩培養24 h,4 000 r·min-1離心10 min,收集菌體沉淀,溶于50 mL 0.9%(m/V)的氯化鈉溶液中,制得菌懸液。分別用濃度為1 mol·L-1HCl和NaOH溶液將YPD培養基pH依次調為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,將菌懸液以2%(V/V)接種量接入到上述不同pH的YPD培養基,30 ℃ 150 r·min-1培養12 h,取樣梯度稀釋后,涂布于YPD固體培養基上,30 ℃培養24 h。存活率計算公式為：

存活率(%)=不同pH YPD培養基中活菌數/YPD培養基中活菌數×100%

1.2.4.2 菌株的膽鹽耐受性

配制濃度為0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.3%(m/V)的膽鹽-YPD培養基。將菌懸液以2%(V/V)接種量接入到不同濃度的膽鹽-YPD培養基,30 ℃、150 r·min-1培養12 h,取樣梯度稀釋后,涂布于YPD固體培養基上,30 ℃培養24 h。存活率計算公式為：

存活率(%)=膽鹽-YPD培養基中活菌數/YPD培養基中活菌數×100%

1.2.5 培養基組分對菌株產EPS及生長的影響

在YPD基礎產糖培養基的基礎上,依次考察碳源種類(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖和木糖)、最適碳源濃度、有機氮源種類(酵母浸粉、胰胨、蛋白胨、牛肉膏和玉米漿)、最適有機氮源濃度、無機氮源種類(硫酸銨、氯化銨、草酸銨和硝酸銨)、最適無機氮源濃度、磷酸二氫鉀濃度和其他金屬陽離子(Mg2+、Na+、Ca2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+)對菌株EPS產量及生長的影響。

1.2.6 培養條件對菌株產EPS及生長的影響

在優化培養基組分的基礎上,依次考察接種量(1%～5%)、培養基初始pH(4～9)、搖床轉速(100～160 r·min-1)、溫度(22～34 ℃)和發酵時間(24～168 h)對菌株EPS產量及生長的影響。

1.2.7 統計分析方法

所有處理均設置3個平行,數據以(均值±標準差)形式表示。采用JMP10.0進行統計分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 產EPS酵母菌的初篩

經培養后,在YPD產糖固體培養基平板上,有8株菌的菌落呈現較大且粘稠的狀態,初步鑒定為能夠產EPS的酵母菌,分別編號01～08。

2.2 產EPS酵母菌的復篩

8株酵母菌EPS產量分別為(2.91±0.16) g·L-1(酵母菌01)、(2.12±0.19) g·L-1(酵母菌02)、(3.27±0.22) g·L-1(酵母菌03)、(3.14±0.11) g·L-1(酵母菌04)、(1.18±0.24) g·L-1(酵母菌05)、(1.67±0.21) g·L-1(酵母菌06)、(1.13±0.11) g·L-1(酵母菌07)和(2.39±0.11) g·L-1(酵母菌08)。通過比較,酵母菌03 的EPS產量最高。與其他產EPS酵母菌相比[11,19],本文酵母菌03產EPS能力相對較強,作為后續研究供試菌株。

2.3 高產EPS酵母菌的鑒定

2.3.1 菌落及菌體形態

在YPD瓊脂培養基上,酵母菌03呈現圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑、有光澤、隆起,如圖1(a)所示;在基礎產糖瓊脂培養基上,酵母菌03菌落呈微黃色,較大且粘稠,如圖1(b)所示。趙英杰等在乳扇中分離的產EPS酵母菌展現了相似的菌落特征[20]。由圖1(c)SEM結果可知,酵母菌03菌體為橢圓形,大小為(2.5～10.0)μm ×(4.5～21.0)μm,符合酵母菌的基本形態特征。

圖1 酵母菌03在YPD(a)、基礎產糖培養基(b)上的菌落形態及SEM顯微形態(c)(5 520×)Fig.1 Colony morphology on YPD (a),basic polysaccharides-producing medium (b) and microscopic morphology under SEM (c) (5 520×) of strain 03

2.3.2 生理生化特征

由表1可知,酵母菌03的底物利用與S.cerevisiae相似,相似度達到94.4%,能夠利用D-葡萄糖、甘油、D-半乳糖、D-麥芽糖、D-蔗糖和D-棉子糖,不能利用L-阿拉伯糖、木糖醇、山梨醇、纖維二糖、海藻糖等。

表1 菌株03的API 20C鑒定結果Table1 Identification results of strain 03 based on API 20C test

2.3.3 18S rDNA序列分析和系統發育樹

菌株03的18S rDNA部分序列長度為1 377 bp,GenBank登錄號為MW672352。該序列的系統發育樹見圖2,該序列與S.cerevisiaeNJJUMSS12(MH104611.1)的18S rDNA部分序列同源性為96%。結合形態及生理生化結果,鑒定菌株03為S.cerevisiae,編號Y3。

圖2 Neighbor-Joining法構建的酵母菌03系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Yeast 03 by Neighbor-Joining method

2.4 S.cerevisiae Y3身體內環境耐受性

2.4.1S.cerevisiaeY3 的pH耐受性

正常情況下,人體胃液pH為3.0左右,進食后胃液中的pH發生變化,偏酸性食物可使pH降低到1.5左右。大多數菌株在低pH環境下無法存活[21-22],因此,有潛質的益生菌應該具有較強的耐酸能力[23]。菌株S.cerevisiaeY3的pH耐受性結果如圖3(a)所示,在pH 3.0～8.0時,菌株均有一定的存活率,且在20%以上,pH為2.0時,仍有(8.08±3.45)%的存活率,有較強的耐酸能力。Yildiran等研究發現,S.cerevisiae作為一種最常用的益生菌,能在pH為2.5的環境下存活8 h,耐酸性較強[12]。因此,S.cerevisiaeY3具有作為益生菌的潛力。

注：不同小寫字母表示不同pH(a)和膽鹽濃度(b)數據間差異顯著,P<0.05。

2.4.2S.cerevisiaeY3的膽鹽耐受性

益生菌經過胃液后,在小腸發揮作用。通常,小腸中膽鹽濃度為0.03%～0.3%[24],而大多數菌株不能在該濃度范圍內生長,具有良好的耐膽鹽能力才能在腸道中定殖生存[25]。菌株S.cerevisiaeY3膽鹽耐受性結果如圖3(b)所示,當膽鹽濃度升高至0.3%時,菌株仍有一定的存活能力,存活率可以達到(18.12±3.36)%,表現出較強的膽鹽耐受能力。

2.5 培養基組分對S.cerevisiae Y3產EPS及生長的影響

2.5.1 碳源對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

碳源是微生物生長代謝和產EPS的主要基質[26]。如圖4(a)所示,S.cerevisiaeY3 EPS的合成及菌株的生長在不同的碳源影響下存在顯著差異(P<0.01)。當以蔗糖為碳源時,S.cerevisiaeY3 EPS產量和OD600最大,分別為(2.13±0.09) g·L-1和(0.42±0.02),其次是果糖,而木糖最不利于菌株生長及EPS合成。因此,選擇蔗糖作為S.cerevisiaeY3產EPS的最佳碳源。楊迎風等同樣發現蔗糖是酵母菌YF01-g產EPS的最適碳源[27]。Gientka等通過對Candida合成EPS的碳源進行研究,發現當最佳碳源為麥芽糖時,EPS產量最高[10]。因此,酵母菌EPS合成與生長的最佳碳源存在種屬特異性,這可能是因為菌株的糖類代謝基因水平不同,使得菌株EPS的合成方式不同,從而影響菌株EPS的合成及生長。

注：不同大寫字母表示不同碳源(a)和蔗糖濃度(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;

不同濃度蔗糖對菌株產EPS和生長情況如圖4(b)所示,隨蔗糖濃度的增高,S.cerevisiaeY3 EPS產量呈現先增加后稍降低的趨勢,當蔗糖含量為7%時,EPS產量最高為(3.05±0.15) g·L-1。高濃度蔗糖抑制菌株的生長和EPS的產量,這可能是由于蔗糖濃度過高,菌株產EPS能力增強,形成大量較粘稠狀糖,阻礙細胞對營養物質的獲取,從而影響菌株EPS的合成及生長。

2.5.2 氮源對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

氮源為微生物生長發育提供所需的氮素營養物質[28]。如圖5和圖6所示,對S.cerevisiaeY3 EPS合成及生長影響較大的有機氮源為酵母浸粉,無機氮源為氯化銨。當酵母浸粉濃度和氯化銨濃度分別為0.2%和0.15%時,EPS產量最高,分別為(3.22±0.2)和(3.29±0.16) g·L-1。周曉蘭等探究了S.cerevisiaeS是S-12- 4產EPS的發酵條件,發現酵母浸粉和氯化銨相結合時,菌株EPS的產量最高,生長最好[29],與本研究結果相符。

注： 不同大寫字母表示不同有機氮源(a)和酵母浸粉濃度(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;

注： 不同大寫字母表示不同無機氮源(a)和氯化銨濃度(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;不同小寫字母表示無機氮源(a)和氯化銨濃度(b)對OD600影響差異顯著,P<0.05。

2.5.3 磷酸二氫鉀濃度對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

磷酸二氫鉀不僅可以調節微生物生長的pH,還為微生物生長發育提供所需的微量元素[30]。如圖7(a)所示,隨著磷酸二氫鉀濃度的增加,S.cerevisiaeY3 EPS產量和菌株生長量呈現先升高后降低的趨勢,磷酸二氫鉀濃度過高,EPS的合成和菌株的生長受到抑制。因此,當磷酸二氫鉀含量為0.15%時,EPS產量最高,為(3.40±0.21) g·L-1。

注：不同大寫字母表示磷酸二氫鉀濃度(a)和金屬陽離子(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;

2.5.4 其他金屬陽離子對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

如圖7(b)所示,S.cerevisiaeY3 EPS產量受金屬陽離子的影響顯著(P<0.05),其中鈣離子可以顯著促進菌株EPS的合成及生長。包怡紅等對影響I.orientalisZ20 EPS產量及生長量的金屬陽離子進行研究,發現鈣離子影響顯著[11],與本研究結果一致。

2.6 培養條件對S.cerevisiae Y3產EPS及生長的影響

2.6.1 接種量對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

如圖8(a)所示,接種量為1%時,EPS產量最低,可能是菌株由于接種量少而生長緩慢,EPS產量隨之減少。接種量增加至2%時,EPS產量最高,為(3.61±0.14) g·L-1。當接種量超過2%時,EPS產量稍降低,可能是因為菌株隨著接種量的增大而生長過快,造成培養基溶解氧不足,從而減少EPS的合成。

注： 不同大寫字母表示接種量(a)和培養基初始pH(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;不同小寫字母表示接種量(a)和培養基初始pH(b)對OD600影響差異顯著,P<0.05。

2.6.2 培養基初始pH對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

培養基的初始pH是菌株發酵代謝的重要因素[31]。pH首先影響菌株細胞膜的通透性,進而影響細胞吸收營養物質的能力,最終影響菌株合成EPS的能力[2]。如圖8(b)所示,EPS的產量隨著pH的升高呈先升高再降低的趨勢,pH為7時,EPS產量最高,為(3.80±0.11) g·L-1。Zhao等對酵母菌Y68產EPS的條件進行優化,發現初始pH為7時EPS產量最高[32],與本文結果一致。

2.6.3 搖床轉速對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

如圖9(a)所示,隨著搖床轉速的增加,EPS的產量先上升后下降。當轉速為140 r·min-1時,EPS產量高達(4.11±0.08) g·L-1,當轉速達到160 r·min-1,EPS產量減少,這可能是因為轉速過高易對菌體造成機械性損傷,從而抑制了菌株S.cerevisiaeY3產生EPS。

注：不同大寫字母表示搖床轉速(a)和溫度(b)對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;

2.6.4 溫度對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

由圖9(b)可知,當溫度較低時,EPS合成量較少,這可能是由于溫度過低,菌株生長緩慢,抑制了EPS的合成。當溫度為30 ℃時,EPS含量達到最高,為(4.13±0.17) g·L-1。溫度過高時,EPS產量下降,這可能是由于在高溫條件下,菌株代謝加快,EPS合成后無法累積,進而導致EPS產量減少。益生菌斯達油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)VIT-MN03在30 ℃培養時,菌株生長量和EPS產量最高[2],與本研究結果一致。

2.6.5培養時間對S.cerevisiaeY3產EPS及生長的影響

如圖10所示,發酵前72 h,S.cerevisiaeY3生長較快,而EPS合成較慢,之后EPS合成快速增加。發酵144 h時,EPS產量達到最高,為(4.34±0.15) g·L-1。繼續延長發酵時間,EPS合成減慢,可能是菌株在發酵后期,培養基中營養成分消耗殆盡,使EPS發生降解或菌株利用已合成的EPS進行生長,從而降低EPS的產量。

注：不同大寫字母表示不同培養時間對EPS產量影響差異顯著,P<0.05;不同小寫字母表示不同培養時間對OD600影響差異顯著,P<0.05圖10 培養時間對S.cerevisiae Y3產EPS和生長的影響Fig.10 Effect of time on EPS yield and growth of S.cerevisiae Y3

3 結 論

從實驗室保藏的酵母菌中篩選出1株高產EPS酵母菌,經鑒定該菌株為S.cerevisiae,編號為Y3。S.cerevisiaeY3具有良好的pH和膽鹽耐受能力。通過單因素試驗確定菌株產EPS的最佳培養基組分為：蔗糖7%、酵母浸粉0.2%、氯化銨0.15%、磷酸二氫鉀0.15%、氯化鈣0.02%;最佳培養條件為：接種量2%、初始pH 7、搖床轉速140 r·min-1、培養溫度30 ℃、培養時間144 h時,菌株EPS產量為4.34 g·L-1,是優化前(1.88±0.12) g·L-1的2.30倍。與目前已報道的產EPS酵母菌相比,S.cerevisiaeY3體內存活率高、耐受性較好、EPS產量較高。因此,利用該菌株發酵產EPS,不僅可作為益生菌在體內發揮益生作用,還可以豐富EPS生產的菌種來源,為酵母菌EPS的大規模生產提供理論基礎。