藏綿羊不同部位骨骼肌營養成分、肌纖維特性及與相關基因表達的關聯分析

趙 麗,沈繼源,包高良,趙鵬飛,石斌剛,劉 秀,李少斌,羅玉柱

甘肅農業大學 動物科學技術學院/甘肅省草食動物生物技術重點實驗室,蘭州 730070)

中國是羊肉生產大國,也是消費大國。隨著消費者生活水平的提高,人們對羊肉品質的要求也不斷提高,生產高檔羊肉成為產業發展的必然趨勢。肌肉營養成分是衡量肌肉品質的重要指標[1]。肌纖維直徑、密度及橫截面積等指標反映肌纖維特性,也直接影響動物的產肉潛力及肌肉嫩度等肉品質指標[2]。骨骼肌占動物體的40%,其主要由大量的肌纖維組成。成年動物的骨骼肌生長以肌肉蛋白質合成主導的骨骼肌肥大為主,主要體現在肌纖維直徑和橫截面積的增加。不同部位肌肉會因運動量的差異導致肌纖維呈不同程度的肥大,同時也會導致肌內脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉積量的差異,進而影響肉的品質[3]。

動物骨骼肌肥大和肌內脂肪沉積受大量功能基因及信號通路的調控,其中AKT-mTOR信號通路是調控骨骼肌肥大的主要信號通路。有研究發現,骨骼肌細胞內Wnt7a通過其受體激活AKT-mTOR信號通路,從而促進肌管分化和肌纖維肥大[4]。從曉霞[5]研究發現,抑制AKT或mTOR會降低蛋白的合成,削弱骨骼肌再生修復能力,導致肌腱中膠原纖維直徑變小。Sandri 等[6]研究發現,AKT具有調節肌肉蛋白質合成代謝的功能,在敲除AKT1和AKT2鼠模型中可見明顯的肌肉萎縮。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)的一種亞型[7],它可以通過磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)調控細胞生長、蛋白質合成等多種代謝過程[8]。 mTOR通過磷酸化下游的效應蛋白p70S6K和4E-BP1,從而調控骨骼肌的生長發育[9]。Bodine等[10-11]通過應用mTOR抑制劑干預SD大鼠動物模型發現,mTOR以及其下游的目標蛋白參與骨骼肌肥大過程。以往的大量研究證實AKT1、mTOR參與調控蛋白質代謝過程[5,12]。脂肪酸結合蛋白3 (FABP3)是結合脂肪酸的FABP家族成員之一,主要表達于成熟心肌細胞和骨骼肌。已有研究證明,FABP3參與肌肉中脂肪酸轉運和脂肪沉積[13-14],其正調控肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)沉積量[15-16],進而影響肌肉嫩度和多汁性[17]。關于AKT-mTOR信號通路調控骨骼肌肥大的研究目前主要集中在人及嚙齒類動物上,在藏綿羊上的研究尚未見報道。同時關于FABP3基因調控綿羊不同部位肌肉脂肪沉積的研究也未見報道。

本試驗以3歲藏綿羊為研究對象,比較7個部位肌肉組織中的肌肉營養成分及肌纖維特性,分析AKT1、mTOR和FABP3基因在7個肌肉部位的表達量差異。同時分析不同部位肌肉營養成分和肌纖維特性與AKT1、mTOR和FABP3基因表達的相關性,以期為藏綿羊肌肉發育及肉品質的研究提供理論基礎,同時也為藏綿羊種質資源的科學利用與發展提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取青海省海晏縣自然放牧條件下,生長發育正常的3歲成年藏綿羊母羊3只,屠宰后分別采集臂三頭肌(Triceps brachii)、岡上肌(Supraspinatus)、股四頭肌(Quadriceps femoris,)、背最長肌(longissimus dorsi)、腰大肌(Psoas major)、胸斜方肌(Trapezius thoracalis)和小腿肌(Leg muscle)的肌肉組織各3個重復分別置于冰盒和液氮中,用于肌肉營養成分測定和總RNA的提取。同時采集長寬厚為3 cm×2 cm×1 cm大小的以上各部位肌肉組織各3份,置于4%多聚甲醛固定液中,用于后續蘇木精-伊紅H&E染色。

1.2 試驗方法

1.2.1 肌肉營養成分分析 將冷凍肌肉樣品在室溫解凍后進行營養品質的測定。肌肉水分含量、粗蛋白含量及肌內脂肪(IMF)含量分別按國標GB/T 9695.15-2008、GB/T 5009.15-2016 和GB/T14772-1993方法進行測定。

1.2.2 肌纖維特征分析 分別取出置于4%多聚甲醛固定液中的待測組織塊,修剪為長寬厚為0.5 cm×0.2 cm×0.2 cm的組織塊,按照常規的石蠟切片方法進行脫水、包埋、切片、H&E染色、封片,最后鏡檢合格的樣片在尼康生物顯微鏡 Ci-L(日本)熒光成像系統進行拍照。使用Image-pro plus 6.0分析軟件,分別測量200倍照片中每個視野內的肌纖維數量、總面積以及視野面積,并計算出單個平均面積以及肌纖維密度,每張切片選取5個大小均一的肌纖維,測量肌纖維直徑。

1.2.3 RNA 提取與 cDNA 合成 按照Trizol試劑盒(Ambion)說明書進行肌肉組織總RNA的提取,通過NanoDrop One超微量紫外分光光度計(Thermo,美國)檢測總 RNA 濃度和純度后,用Evo M-MLV反轉錄試劑盒(艾科瑞生物,湖南,中國)將 RNA 反轉錄為cDNA。反轉錄的 cDNA 置于-20 ℃保存,用于檢測相關基因的表達量。

1.2.4 引物設計與合成 參考NCBI上綿羊AKT1、mTOR、FABP3基因的序列信息,以β-actin為內參基因,用 Primer v 5.0 軟件(Premier Biosoft International,Germany)設計引物(表 1),引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司(北京,中國)合成。

表1 AKT1、 mTOR、 FABP3基因引物序列Table 1 Primer sequence of AKT1, mTOR and FABP3 gene

1.2.5 實時熒光定量PCR 根據ChamQ Universal SYBR Green PCR 試劑盒(Q711002/03,Vazyme)說明書,使用實時熒光定量PCR技術檢測肌肉發育相關基因在7個部位肌肉組織中的相對表達量。反應體系的總體積為20 μL,整個反應過程在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex 實時PCR儀(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)上進行,反應條件為:95 ℃預變性 30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s(共40個循環)。每類樣品各做3個生物學重復和3個技術重復。

1.3 數據分析

采用Excel 2010整理數據,用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析、雙變量簡單相關進行Pearson相關系數計算以及差異顯著性檢驗;多重比較采用Duncan氏法,結果以“平均值±標準差”表示。使用2-△△Ct法計算基因的相對表達量,用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 藏綿羊不同部位肌肉的營養成分比較

由表2可知,藏綿羊不同部位肌肉水分含量無顯著差異(P>0.05)。小腿肌蛋白含量顯著高于臂三頭肌、腰大肌和胸斜方肌(P<0.05),與背最長肌、股四頭肌及岡上肌無顯著差異(P> 0.05)。背最長肌中肌內脂肪含量最高,與腰大肌肌內脂肪含量無顯著差異(P>0.05),小腿肌中肌內脂肪含量顯著低于其他部位(P<0.05)。

表2 藏綿羊不同部位肌肉營養成分Table 2 Nutritional composition of different parts of muscle in Tibetan sheep %

2.2 藏綿羊不同部位肌肉的肌纖維特性比較

肌纖維特性分析結果表明(圖1,表3),藏綿羊不同部位肌肉組織的肌纖維橫截面積大小為岡上肌>股四頭肌>臂三頭肌>小腿肌>胸斜方肌>腰大肌>背最長肌,其中背最長肌的肌纖維橫截面積最小,且顯著低于其他各部位(P<0.05);不同部位肌肉組織的肌纖維直徑大小為股四頭肌>岡上肌>小腿肌>臂三頭肌>腰大肌>胸斜方肌>背最長肌,各部位肌肉的肌纖維直徑大小差異不顯著(P>0.05);不同部位肌肉組織的肌纖維密度大小為背最長肌>腰大肌>胸斜方肌>臂三頭肌>小腿肌>股四頭肌>岡上肌,其中背最長肌的肌纖維密度顯著大于岡上肌(P<0.05)。綜上,藏綿羊背最長肌的肌纖維橫截面積和肌纖維直徑最小,而肌纖維密度最大。

A.臂三頭肌 B.岡上肌 C.股四頭肌 D.背最長肌 E.腰大肌 F.胸斜方肌 G.小腿肌A.Arm triceps; B.Supraspinatus; C.Quadriceps femoris; D.Longissimus dorsi; E.Psoas major ; F.Trapezius thoracalis; G.Calf muscle圖1 肌纖維的H&E染色Fig.1 H&E staining of muscle fibers

表3 藏綿羊不同部位肌肉的肌纖維比較Table 3 Comparison of muscle fibers in different muscles of Tibetan sheep

2.3 藏綿羊不同部位肌肉中產肉性能相關基因表達量比較

利用實時熒光定量PCR技術檢測與肌肉生長發育相關的AKT1、mTOR基因及與肌內脂肪沉積相關的FABP3基因在臂三頭肌、岡上肌、股四頭肌、背最長肌、腰大肌、胸斜方肌和小腿肌中的相對表達量(圖2)。結果顯示,小腿肌中AKT1的表達量最高,且顯著高于其他各部位肌肉組織(P<0.05),腰大肌中AKT1的相對表達量最低;股四頭肌中mTOR的相對表達量最高,其次是背最長肌和小腿肌(P>0.05),胸斜方肌中mTOR的相對表達量低于股四頭肌和小腿肌(P<0.05);背最長肌中FABP3的相對表達量高于岡上肌、胸斜方肌及小腿肌(P<0.05),而與臂三頭肌、股四頭肌及腰大肌差異不顯著(P>0.05)。

The relative expression level of the gene in the arm triceps is set to 1.The same lowercase letters indicate insignificant differences (P>0.05),and different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05)圖2 藏綿羊不同部位肌肉組織 AKT1、 mTOR、 FABP3基因的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of AKT1, mTOR and FABP3 genes in different parts of muscle tissue in Tibetan sheep

2.4 藏綿羊肌肉中各指標間的相關性

由表4可知,藏綿羊肌肉中蛋白、肌內脂肪含量均與水分含量呈負相關;肌纖維面積、直徑與肌內脂肪均呈負相關,而肌纖維密度與肌內脂肪呈正相關;肌纖維面積與肌纖維直徑之間呈極顯著正相關(r=0.842,P<0.01),而與肌纖維密度呈極顯著負相關(r=-0.906、-0.831,P<0.01);基因AKT1和mTOR與蛋白含量均呈正相關,其中AKT1與蛋白含量呈極顯著正相關(r= 0.601,P<0.01);此外,基因AKT1與肌內脂肪含量呈顯著負相關(r=-0.496,P<0.05),mTOR與肌內脂肪含量呈正相關(r=0.038,P>0.05);FABP3基因與肌內脂肪含量呈極顯著正相關 (r=0.728,P<0.01)。

表4 各指標之間的相關性分析(雙尾檢驗,N=21)Table 4 Correlation analysis between indicators (two-tailed test,N=21)

3 討 論

肌肉營養成分對肉的口感、嫩度和風味等肉品質指標具有重要意義[18]。肌肉中的水分含量直接影響肉的嫩度和口感等肉品質指標[19]。《中國食物成分2004》[20]參考標準顯示羊肉的平均含水量為75.23%(中國食物成分,2004),這與本研究結果一致。本研究中藏綿羊不同部位肌肉含水量均在75%左右,與常明華[21]報道的青海省貴南縣白藏綿羊水分含量(75.35%)相當。羊肉中含有豐富的蛋白質,其含量一般為15%～20%。蛋白質含量的高低是衡量肉品質的重要指標,羊肉的蛋白質含量越高,其營養價值也會越高[22]。本研究發現藏綿羊不同部位肌肉蛋白含量均在20%左右,說明藏綿羊肉的營養價值較高,可作為重要的食物蛋白質來源。李述剛[23]對南疆不同品種綿羊的前腿、背最長肌、后腿和尾脂的蛋白含量進行測定發現,同一品種不同部位蛋白含量亦存在較大差異,其中差異最大的是尾脂(蛋白含量只有3.07%),其他部位蛋白含量依次為背最長肌>前腿>后腿。本研究發現藏綿羊小腿肌的蛋白含量最高,其次是背最長肌(P>0.05);腰大肌的蛋白含量極顯著低于小腿肌(P<0.01),此研究結果與郭元等[24]對小尾寒羊腿部、前腿、后腿臂三頭肌中基因的相對表達量設為1。相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

及脊背等不同部位羊肉理化特性比較結果相一致。肌內脂肪 (IMF) 含量是影響畜禽肉質的重要因素之一,與肉的風味、多汁性、嫩度等肉質性狀相關[25-26]。肌內脂肪含量越高,導致單位肌肉面積上肌纖維數量減少,使得咀嚼時肉的韌性降低,從而提高肌肉的嫩度和口感[27]。肌內脂肪是由肌內脂肪組織和肌纖維中的脂肪組成,而肌纖維中的脂肪則是由肌漿中的三酰基甘油液滴、膜脂(主要是磷脂)和膽固醇等組成[28]。不同的肌肉解剖部位,肌纖維中三酰基甘油含量的差異很大。喬永[29]在對綿羊羔羊和成年羊的研究中發現,肌內脂肪有較明顯的解剖部位差異。本研究發現,背最長肌肌內脂肪含量高于其他部位(P<0.05),與腰大肌肌內脂肪含量差異不顯著(P>0.05),而小腿肌肌內脂肪含量最低(1.15%),表明背最長肌相比于其他部位口感和嫩度更好。苗彥芳[30]在對內蒙古白絨山羊背最長肌、股二頭肌、股四頭肌等11個部位肌肉肉品質的研究中發現,背最長肌沉積脂肪的能力最強。Caneque等[31]對不同胴體質量的Manchego羔羊研究發現,背最長肌和股四頭肌相比肌內脂肪含量更高。以上研究均與本研究結果類似。綜合來看,小腿肌更符合人們對羊肉高蛋白、低脂肪的要求,而背最長肌在感官體驗上優于其他部位肌肉。

骨骼肌是動物肉類產品中最重要的組成部分,肌纖維作為骨骼肌的基本組成單位對動物的產肉力和肉品質有直接影響[32]。肌纖維直徑、密度、橫截面積是反映肌纖維特性的3個重要指標。研究表明,肌纖維的形成及增殖主要發生于胚胎期,出生后肌纖維數量通常不變,而是以肥大的方式進一步發育,從而導致肌纖維的直徑和橫截面積增大,同時肌纖維的密度變小[33]。研究表明,肌纖維橫截面積和直徑增大會降低肌肉的嫩度和系水力[34];相反,肌纖維直徑越小,其密度越大,肌內脂肪含量越高,肉的嫩度也就越好,肉品質優良[35]。Fahey等[36]研究發現,肌肉嫩度與肌纖維直徑呈負相關,與肌纖維密度呈正相關,而肌纖維橫截面積與肉的嫩度呈負相關。本研究發現,藏綿羊不同部位肌肉組織的肌纖維橫截面積大小為岡上肌>股四頭肌>臂三頭肌>小腿肌>胸斜方肌>腰大肌>背最長肌,其中背最長肌的肌纖維橫截面積最小,且顯著低于其他各部位(P< 0.05);肌纖維直徑大小是股四頭肌>岡上肌>小腿肌>臂三頭肌>腰大肌>胸斜方肌>背最長肌;藏綿羊背最長肌的肌纖維密度最大,且高于岡上肌(P<0.05)。說明背最長肌的嫩度優于其他部位肌肉。此外,肌纖維面積、直徑與肌內脂肪含量均呈負相關,而肌纖維密度與肌內脂肪含量呈正相關;肌纖維面積與肌纖維直徑呈極顯著正相關(r=0.842,P<0.01),而肌纖維面積和肌纖維直徑與肌纖維密度均呈極顯著負相關(相關系數分別為-0.906、-0.831,P<0.01)。此研究結果與Bunger 等[37]在不同品種綿羊的研究結果相一致。

已有研究證實AKT1、mTOR參與肌肉蛋白合成過程,進而正向調控骨骼肌肥大。而FABPs基因編碼脂肪酸結合蛋白,脂肪酸結合蛋白是影響脂肪沉積的重要基因,對機體脂肪代謝具有重要調控作用[38]。有研究表明,AKT1對肌肉中蛋白質合成有正調控作用,mTOR是AKT下游因子,當AKT被激活,引起mTOR的激活進而經由兩條主要的傳導通路磷酸化下游的效應蛋白p70S6k和4E-BP1(兩者均是蛋白翻譯的關鍵調控因子),從而促進肌肉的肥大性生長[39]。栗敏杰等[40]研究表明,AKT1的相對表達量與不同部位肌肉中蛋白質的含量呈中等或強正相關(相關系數0.21～0.65),對肌肉中蛋白質合成有正調控作用,而mTOR作為AKT1的下游因子在肌肉中的相對表達量趨勢與AKT1相一致。本研究發現蛋白含量最高的小腿肌中AKT1的相對表達量也顯著高于其他部位(P<0.05),且AKT1基因的表達量與蛋白含量呈強正相關(相關系數r=0.601,P<0.01)。mTOR在股四頭肌中的相對表達量與小腿肌、背最長肌差異不顯著(P>0.05),顯著高于臂三頭肌、岡上肌及腰大肌(P<0.05),而與胸斜方肌差異極顯著(P<0.01),該基因的相對表達量與蛋白含量亦呈正相關(相關系數r=0.291),與栗敏杰等[40]研究結果相一致。綜合分析發現,肌肉蛋白質受AKT1和mTOR基因的調控。本研究中mTOR在股四頭肌中的相對表達量較高,可能由于藏綿羊機體內AKT-mTOR通路的作用機制與其他品種不同。此外,有研究表明心臟型脂肪酸結合蛋白(FABP3)的表達水平與肌內脂肪密切相關,是影響畜禽肌內脂肪含量的候選主效基因[17]。不同部位肌肉組織中FABP3的相對表達量各有差異。艾錦新等[41]對FABP3基因在黔北麻羊各組織的表達分析,發現FABP3基因在心臟的表達量最高,其次是背最長肌,這與胡江等[17]研究FABP3基因在甘南牦牛各組織的相對表達量結果相一致。本研究中,背最長肌肌內脂肪含量最高,小腿肌中肌內脂肪含量最低,且FABP3在小腿肌中的相對表達量低于除岡上肌外的其他部位(P<0.05)。另外,不同部位肌肉組織中FABP3的相對表達量與肌內脂肪含量呈不同程度的正相關。Huang等[42]對30～90日齡的公哈薩克綿羊肌肉組織進行研究,發現FABP3基因的mRNA表達水平與肌內脂肪含量呈極顯著的強正相關。岳彩娟等[43]研究發現,FABP3基因的表達量與灘羊背最長肌、股二頭肌及腰大肌肌內脂肪含量均呈正相關。在本研究中,FABP3基因與肌內脂肪含量呈極顯著正相關(相關系數r=0.728,P<0.01),與岳彩娟等[43]研究結果相一致,進一步說明FABP3參與調節脂肪代謝。這些研究結果表明,FABP3基因可能是影響動物生長發育的重要基因。

4 結 論

藏綿羊小腿肌中蛋白和肌內脂肪含量更符合人們對羊肉高蛋白、低脂肪的要求,背最長肌的肌內脂肪含量高于其他部位,口感更好。肌纖維特性與肌肉營養成分之間存在不同程度的相關性,其中肌纖維面積、直徑與肌內脂肪含量均呈負相關,而肌纖維密度與肌內脂肪呈正相關。AKT1和mTOR基因表達量與藏綿羊不同部位肌肉蛋白質合成呈正相關,FABP3表達量與藏綿羊不同部位肌肉肌內脂肪沉積呈正相關。