內蒙古草原革蜱的鑒定、人工飼養及生活史觀察

馬懿敏,周文凱,楊 波,韓文雄,賀泓凱,王 揚,孫 晶,張 媛,趙維宏,張占勝,柴海亮,王利峰,劉永宏,趙 麗

(1.內蒙古農業大學 獸醫學院家畜病理學實驗室,呼和浩特 010018;2.農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室,呼和浩特 010018;3.鄂爾多斯市動物疫病預防控制中心,內蒙古鄂爾多斯 017000;4.內蒙古賽科星繁育生物技術(集團)股份有限公司,呼和浩特 011517)

蜱(Tick)是哺乳類、鳥類、爬行類和兩棲類等動物體表常見的以吸血為生的體外寄生蟲,世界已知蜱包括硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)、納蜱科(Nuttalliellidae)和恐蜱科(Deinocrotonidae)4科21屬960種[1],中國記錄的蜱有2科10屬121種[2],其中占多數、危害最大的為硬蜱科蜱[3]。經蜱叮咬,宿主局部組織破損、水腫、潰瘍或因繼發感染引起化膿、疼痛、皮炎、貧血、消瘦、麻痹等;更重要的是,蜱作為世界第二大病原傳播媒介,在叮咬、吸血時傳播病毒、螺旋體、立克次氏體、細菌或原蟲等病原,具有把野生動物或家畜疾病傳播給人的風險,危害人類健康[4-7]。

草原革蜱(Dermacentornuttalli),屬硬蜱科(Ixodinae)、革蜱屬(Dermacentor)[1],其宿主范圍廣泛,成蜱主要寄生于大型哺乳類動物,如牛、犬、馬、駱駝、綿羊和山羊等,有時也侵襲人;幼蜱和若蜱寄生于各種小型嚙齒類動物[7]。該蜱廣泛分布于北京、黑龍江、吉林、河北、遼寧、內蒙古和新疆等中國北方地區[8],且為內蒙古地區優勢蜱種[9-11]。D.nuttalli成蜱主要在春季活動,幼蜱、若蜱出現于夏、秋兩季,一年發育一個世代,以成蟲階段越冬[12]。已報道D.nuttalli可傳播綿羊無漿體(Anaplasmaovis)、綿羊泰勒蟲(Theilerialuwenshuni)、布魯氏桿菌(Brucella)、饒氏立克次體(Rickettsiaraoultii)、埃氏立克次體(R.aeschlimannii)、嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)[13]、馬泰勒蟲(Theileriaequi)[14]、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)[15]、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)[16]、巴貝斯原蟲(Babesia)[17]等病原。

實驗室人工飼養蜱不僅能夠掌握蜱的發育生活史、生物學特性等,還可為蜱及蜱傳疾病的研究提供充足、可控發育階段的材料。但有關D.nuttalli的實驗室人工飼養報道較少,只有努爾·庫爾曼艾力等[18]和巴音查汗等[19]在20世紀報道了新疆D.nuttalli的實驗室飼養。本研究針對內蒙古地區優勢蜱種D.nuttalli進行實驗室人工飼養和生活史觀察,以期建立一套詳細規范的D.nuttalli實驗室飼養方法,為D.nuttalli的生物學研究和綜合防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蜱 于2021-04-17采集自內蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎左旗新寶利格蘇木羊體表。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠(6周齡,體質量 25～27 g),為唯一供血動物。

1.1.3 試劑和主要儀器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0(Code No.9765),PremixTaqTM(TakaRaTaqVersion 2.0 plusdye)(Code No.RR901A),4S Green Plus無毒核酸染料(Code No.A616696)、DNA分子量標準(Code No.B600021),購自寶日醫生物工程(北京)有限公司。高速冷凍離心機(Cat No.75004250,ThermoFisher)、PCR儀(Part No.4359659,Gene Company Limited)、電泳儀(Model No.PowerPacTM Universal Power Supply,BIO RAD)、凝膠成像儀(BDA Box 2,Biometra GmbH)、體視顯微鏡(PXS-1040)等。

1.2 方 法

1.2.1 蜱種鑒定 形態學鑒定。對采集的飽血雌成蜱及同一批未飽血成蜱進行清洗處理,用75%乙醇固定后,參照鄧國藩等[20]和巴音查汗等[21]的蜱形態學分類依據,借助體視顯微鏡觀察假頭基、須肢、盾板、肛溝和氣門板等的形態特征,進行形態學初步鑒定。

分子生物學鑒定。飽血雌成蜱產卵后,對其研磨并采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0試劑盒提取核酸,利用16S rDNA基因特異性引物,采用PremixTaqTM(TakaRaTaqVersion 2.0)試劑盒對16S rDNA基因片段進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物、PCR反應體系及反應條件參照文獻[22-23],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 序列測定及分析 將PCR陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,序列應用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLAST在線平臺和DNAstar等軟件,進行序列分析和系統發育進化樹構建。

1.2.3 人工飼養 羊體表叮咬的、飽血將要脫落的雌蜱單只置于含有潮濕脫脂棉的50 mL無菌離心管中,用紗布封口后帶回實驗室。雌蜱開始產卵后,觀察并記錄每日產卵數量、停止產卵時間、形態變化及卵孵化為幼蜱的時間。

以昆明小鼠為唯一供血動物飼養幼蜱和若蜱。首先選取健康昆明小鼠,剃除背毛后將小鼠頸部及后肢用醫用膠布固定,置于2 000 mL燒杯內[24],將幼蜱(若蜱)用醫用棉簽沾取后置于小鼠體表,燒杯壁四周上沿涂抹一層醫用凡士林[18,25],以防小鼠及幼蜱(若蜱)逃逸。吸血完畢后,飽血幼蜱自行從宿主體表脫落,用金屬尖頭鑷或沾水棉簽輕輕將其取出,置于含有潮濕脫脂棉的2.5 mL離心管內,管蓋作好標記,管口扎洞保持空氣暢通,每2～3 d用無菌注射器從管口注水,防止濕度下降。觀察到若蜱飽血后,及時用金屬尖頭鑷,垂直于小鼠體表方向夾飽血若蜱的軀體或假頭,輕輕搖動,順勢取下,謹防小鼠誤食。為了采到完整飽血若蜱,采集前,可用煤油、氯仿或乙醚等藥物涂于叮咬部位[26]。利用體視顯微鏡觀察人工飼養條件下卵孵化到幼蜱,幼蜱到若蜱以及若蜱到成蜱的各期蟲體形態特征,并拍照記錄。

飼養期間,室內自然溫度為20～30 ℃,相對濕度為30%～75%,飼養過程中除自然光照外,不加其他燈光照射,并避免蟲體直接暴露于自然強光下。

2 結果與分析

2.1 草原革蜱鑒定

2.1.1 形態學鑒定 雌蜱:整體為卵圓形;假頭基位于軀體前端呈矩狀;幾丁質盾板覆蓋蟲體背部前1/3處,呈長卵圓形;盾板有銀白色琺瑯斑,后緣似微波狀;頸溝短且深陷,側溝細窄;氣門板呈橢圓形;腹面后部有肛門,肛溝圍繞肛門之后;須肢粗短(圖1-A,1-B)。

A.雌蜱背部;B.雌蜱腹部;C.雄蜱背部;D.雄蜱腹部

雄蜱:蟲體窄長,呈卵圓形;假頭短,假頭基位于軀體前端呈矩形;盾板大且有混雜不均一的銀白色琺瑯斑;氣門板呈逗點狀;肛溝呈半月形,須肢粗短,外緣呈弧形;各足基節順序增大,4對足粗短(圖1-C,1-D)。

基于蜱上述形態結構特征,確定本次試驗采集蜱為革蜱屬蜱。

2.1.2 分子生物學鑒定 蜱樣本DNA經PCR擴增16S rDNA基因,凝膠電泳顯示擴增產物(圖2)與預計大小一致。

M．DNA分子質量標準;N.陰性對照;1～6.蜱16S rDNA基因PCR擴增產物M．DNA Marker;N.Negative control;1-6.PCR amplification products of tick 16S rDNA gene圖2 蜱16S rDNA基因PCR擴增結果Fig.2 PCR analysis of 16S rDNA gene amplification in ticks

測得的2個16S rDNA基因片段長度均為416 bp,BLAST在線分析顯示,與序列1和序列2同源性最高的序列(GenBank登錄號為MH324407.1和JX051114.1)均為D.nuttalli,同源性分別為98.77%和99.26%。2個16S rDNA序列與GenBank中D.nuttalli及其他革蜱屬蜱的16S rDNA序列,運用DNAstar軟件繪制系統發育進化樹(圖3)顯示,序列與已知的D.nuttalli序列聚在同一分支上。

圖3 革蜱屬16S rDNA基因的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA gene sequences of Dermacentor

2.2 草原革蜱人工飼養

2.2.1 飽血雌成蜱產卵期 飽血雌成蜱飽滿呈豆狀,灰褐色,短暫活動1～3 d,然后進入靜止狀態,藏匿于潮濕棉花下,待產卵。其產卵量與飽血程度呈正比,飽血程度越高,產卵量越多。產卵時雌蜱僅肢體微弱活動,通過分泌的黏性物質將卵粘在一起,卵呈堆狀或葡萄串狀聚集于假頭處。產卵期持續13～18 d,平均為15.5 d,產卵總量約2 680～4 050枚,平均約3 393枚,日均產卵量約219枚;產卵期1～6 d為產卵增長期,每日產卵量約為160～300枚,產卵期7～10 d為產卵平衡期,每日產卵量約為320～370枚,隨后產卵量逐漸下降,至最后1、2 d每日產卵量為10～30枚。隨著產卵天數的增加和產卵量的增大,飽血雌蜱體積逐漸變小,表面失去光澤出現花紋,顏色逐漸變為土黃色,后期雌蜱體表干癟、皺縮(圖4),并于產卵結束后3～6 d死亡,顏色變為黑色。

圖4 產卵中的飽血雌成蜱Fig.4 Full blood of female adult tick laying eggs

2.2.2 卵孵化期D.nuttalli的卵為棕黃色,呈橢圓形,半透明狀(圖5)。卵在孵化初期沒有任何明顯變化,隨后卵的顏色變淺,開始由棕黃色逐漸變成透明的乳白色,破殼前卵殼內可見有呈黃褐色的幼蜱。在室溫(內蒙古自治區4～5月)下孵化期為25～29 d,平均為27.38 d。

圖5 體視顯微鏡下的卵Fig.5 Eggs analyzed under stereomicroscope

從飽血雌蜱所產卵中隨機取300枚卵,每30枚卵為一組分別放置于10個2.5 mL離心管中,管中放有浸水的脫脂棉花以維持濕度,卵孵化情況見表1,孵化率為75%～100%,總體孵化率為93.33%(280/300)。

表1 卵孵化情況Table 1 Egg hatching

幼蜱剛孵出時為淺黃色,具3對黃白色足,可緩慢爬動,活動不活躍。經2～3 d后聚集在一起活動,呈堆狀;隨后3～4 d幼蜱體色變深,呈黃褐色(圖6),活動增強且爬行速度加快,具備叮咬侵襲力,積極尋找宿主。幼蜱耐饑餓能力較強,2到3個月未找到宿主寄生仍能保持較強的活力。釋放到供血小鼠體表的幼蜱,經1～2 h開始叮咬寄生,2～3 d時可見體積明顯增大,逐漸變為暗紅色或黑紫色,并有黑色粉末狀物體,幼蜱在小鼠體表吸血至飽血脫落需4～6 d,平均為5.23 d。

圖6 體視顯微鏡下的幼蜱Fig.6 Larva analyzed under stereomicroscope

2.2.3 幼蜱蛻化期D.nuttalli幼蜱飽血后自行脫落,呈芝麻狀,黑紅色,表面光滑,蟲體較吸血前明顯增大(圖7)。在室溫(內蒙古自治區5～6月)條件下,離開宿主后活動2～3 d,準備蛻皮。經人工飼養后收集到飽血幼蜱2 974只,75%乙醇保存92只,-80 ℃凍存1 255只,1 627只進行幼蜱蛻化。蛻化期為4～15 d,主要集中于7～ 11 d,平均約為8.83 d,在此期間成功蛻化為饑餓若蜱的有1 316只,蛻化率為80.89%(1 316/ 1 627),具體蛻化時間及蛻化數量見表2。

表2 幼蜱蛻化時間及蛻化數量Table 2 Degeneration days and number of larva

圖7 體視顯微鏡下的飽血幼蜱Fig.7 Full blood of larva under stereomicroscope

剛蛻變完成的若蜱較幼蜱大,顏色為淺棕色,與成蜱一樣有4對足(圖8),四肢尚未完全伸展,行動遲緩,一般經1～2 d靜伏期后開始活動,活動逐漸增強且爬行速度加快,經蛻皮5～10 d后,排出白色液滴狀物體,即可叮咬寄生。若蜱在吸血過程中也會有黑色粉樣物體排出,隨著吸血時間增加,其體積也逐漸增大,顏色轉為青灰色。若蜱在小鼠體表吸血期為4～8 d,平均約為5.41 d。

圖8 體視顯微鏡下的若蜱Fig.8 Nymph under stereomicroscope

本階段有293只若蜱成功叮咬寄生,逐漸成功收集154只飽血若蜱(表3),75%乙醇保存5只,-80 ℃凍存33只,其余116只飽血若蜱進入下一階段生長發育。

表3 飽血若蜱寄生情況Table 3 Parasitism of bloody nymphs

2.2.4 若蜱蛻化期D.nuttalli若蜱飽血后呈小豆狀,青灰色(圖9),自行離開宿主經1～2 d活動期,進入休止期準備蛻皮。脫落后1～5 d內形態無明顯變化,第10天起表皮開始變白,其體色逐漸由青灰色變為乳白色。在室溫(內蒙古自治區6～8月)條件下,經12～21 d的蛻變期后蛻化為成蜱(圖10、圖11),其中主要集中在12～17 d,平均蛻化時間約為14.81 d。116只飽血若蜱中有79只成功蛻化為成蜱,其蛻化率為68.10%(79/116),包括49只雌蜱和30只雄蜱,成蜱的雌雄比例為1.63∶1。具體蛻化時間、蛻化數量及雌雄比例見表4。

圖9 體視顯微鏡下的飽血若蜱Fig.9 Bloody nymphs under stereomicroscope

圖10 體視顯微鏡下的雌性成蜱Fig.10 Female ticks under stereomicroscope

表4 飽血若蜱蛻化時間、蛻化數量及雌雄比例Table 4 Degeneration number of time and proportion of male and female of bloody nymphs

剛蛻化的成蜱靜臥不動,在離心管內可見一層蛻下的透明薄皮,經1～2 d后在管內緩慢爬行,離心管底部有白色小球狀物體堆積,漸漸活動頻繁。

3 討論及結論

D.nuttalli為三宿主蜱,發育過程包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個階段,需飽血3次才能完成整個發育過程。硬蜱的生殖和發育受多種因素的影響,如地域分布、環境及宿主等因素[27]。人工飼養條件下,不同種蜱的生活史周期不同,同種蜱在不同宿主表現的生活史周期也不同,在不同溫、濕度條件下同種蜱在同種宿主上的生活史周期也存在差異[28]。

本研究中,D.nuttalli在室內條件(20 ℃～30 ℃)下,飽血雌蜱的產卵期約13～18 d,平均15.5 d,單雌產卵量為2 680～4 050枚,產卵期長于巴音查汗等[19]報道的7～13 d,但遠短于呂洪昌等[29]報道的27～35 d和努爾·庫爾曼艾力等[18]的35～40 d;產卵量少于努爾·庫爾曼艾力等[18]報道的8 000～9 200枚及呂洪昌等[29]的 4 628～8 653枚,但與巴音查汗等[19]報道的 3 606枚大體一致,可能與雌蜱飽血程度及體質量等相關。此外,在本研究中的卵經過25～29 d,平均27.38 d孵化成為幼蜱,與巴音查汗等[19]報道的18～28 d大體一致,但長于努爾·庫爾曼艾力等[18]報道的18～20 d,更與呂洪昌等[29]報道的29～42 d相距甚遠,究其原因可能與溫度、濕度、種群自身狀態、不同地域環境來源的蜱等有關。饑餓幼蜱的吸血期平均為5.23 d;飽血幼蜱到饑餓若蜱的蛻皮期平均為8.83 d,與巴音查汗等[19]報道的5.5 d和8 d研究結果基本一致。饑餓若蜱吸血期平均為5.41 d,飽血若蜱到成蜱的蛻皮期平均為14.81 d,均短于巴音查汗等[19]報道的平均8.5 d和21.5 d,這些差異可能與宿主和自身飽血程度等相關。文獻報道在實驗室條件下,D.nuttalli從雌蜱吸血到下一代成蜱共需 62～121 d[12]。本研究發現內蒙地區D.nuttalli從雌蜱產卵到下一代成蜱共需72～114 d,平均需 90.66 d。綜上所述,這些差異可能體現了內蒙D.nuttalli種群地域特性和遺傳多樣性。本次D.nuttalli人工飼養還較詳細地研究了D.nuttalli卵孵化率及其各階段蛻化率,卵孵化率高達93.33%,飽血幼蜱蛻化率為80.89%,飽血若蜱蛻化率為 68.10%,初步推算顯示實驗室條件下一批卵發育到成蜱的概率為51.41%。

蜱類的繁殖、生長與發育所需要的營養物質,必須通過在宿主身上吸血才能獲得。幼蜱、若蜱均需在宿主身上攝取營養,才能發育蛻變進入下一生長階段。D.nuttalli成功叮咬宿主后一般不改變其吸血部位,直至飽血才離開宿主。人工飼養條件下,D.nuttalli幼蜱和若蜱在鼠體叮咬吸血情況良好,飽血后個體差異較小,能正常發育為成蜱。努爾·庫爾曼艾力等[18]曾報道蛻化成功的若蜱不在同一宿主體表吸血寄生,另擇其他宿主;但在本次D.nuttalli人工飼養中,將飽血幼蜱蛻皮完成后的饑餓若蜱繼續接種到同一宿主時仍表現嗜血,且飽血后可正常發育為成蜱。

本研究成功建立了內蒙古D.nuttalli人工飼養方法,明確了從飽血雌蜱產卵至下一代成蜱共需72～114 d,平均需90.66 d。試驗結果初步表明,用昆明小鼠作為內蒙D.nuttalli幼蜱和若蜱的供血動物是可行的,雖然利用供血鼠體大量繁殖有困難,但仍可用于實驗室初期飼養,從而為今后在實驗室擴繁D.nuttalli奠定基礎。