甘草水氮效應研究及基于有效成分的水氮方案

呂學蓮,李 明,白海波,惠 建,李樹華,郭生虎,李云翔,馬海軍,許 興

(1.寧夏大學 農學院,銀川 750021;2.寧夏農林科學院 農業生物技術研究中心,銀川 750002;3.寧夏農林科學院 林業與草地生態研究所,銀川 750002,銀川 750002;4.寧夏農林科學院植物保護研究所,銀川 750002;5.北方民族大學 生物科學與工程學院,銀川 750021)

甘草(GlycyrrhhizauralensisFisch.),多年生豆科草本植物,是中醫藥寶庫中的珍品,也是鮮為人知的大宗中藥材。甘草“渾身是寶”,其根莖部位具有清熱解毒、抗癌消炎、調和諸藥等醫學功效,地上部分是優質的飼草及功能飼料來源[1]。

20世紀末,由于野生甘草不合理采挖,導致野生資源儲量急劇減少。人工種植甘草的興起,解決了一時的燃眉之急,但也伴隨著新的問題,即藥用成分含量較低。通過對全國甘草產區采集的大量甘草樣品檢測發現,野生甘草的甘草酸含量平均為4.43%,遠高于栽培甘草的1.51%[2]。隨著甘草應用越來越廣,市場需求不斷擴大,在當前野生資源不足的情況下,人工栽培甘草也是一種很有效的解決手段,關鍵是通過何種途徑能將人工栽培甘草的品質提高。甘草中主要的活性成分是三萜類及黃酮類,而甘草酸及甘草苷分別是這兩大類物質中的代表性物質,也是《中國藥典》中評價甘草質量優劣的依據[3]。據報道,甘草藥用成分含量的高低與遺傳因素[4-5]、產地[6]及生長階段[7]和栽培條件[8]有關。因此,在現有栽培條件下,如何平衡好各影響因素,使其對甘草品質起到正向的調控作用,是值得研究的關鍵問題。

人工甘草栽培過程中,最直接的農藝措施是灌水和施肥。研究發現氮、磷、鉀對甘草酸含量影響為施氮>施磷>施鉀[9];適度的水肥耦合對甘草產量具有明顯的促進作用[10];氮、磷、鉀肥料不同配比對甘草中甘草酸和甘草苷含量影響不同[11];施磷量對甘草產量的影響呈現先增加后增產不顯著的趨勢[12];單施氮肥有利于甘草地上部分生長,單施磷肥主要促進根系生長,混施氮磷不僅能促進甘草生長,還能提高甘草酸含量[13]。灌水與氮肥對甘草生長指標和藥用成分含量之間關系的研究鮮見報道,且目前甘草栽培缺乏有效的水肥指導依據。本試驗以烏拉爾甘草為研究對象,在寧夏中部干旱帶沙生土壤進行水肥試驗,設立不同梯度的灌水和氮肥組合,研究水氮效應對甘草生長及有效成分含量的影響,并優化出寧夏中部干旱帶沙生土壤甘草灌水施氮方案,為甘草種植的高質量發展提供科學的栽培依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019年4月-2020年11月在寧夏中部干旱帶鹽池縣沙邊子甘草種植基地 (106°30′～107°41′E,37°04′～38°10′N)進行,該區域屬中溫帶大陸性氣候,干旱少雨,風沙大,2019和2020年平均降水量分別為323 mm和201 mm,分布不均,2019年主要集中在6、7和8月,2020年主要集中在 8 月,年均蒸發量為2 180 mm,遠大于降水量。年均氣溫大于20 ℃的月份為6-8月(圖1)。此區域能代表寧夏甘草道地產區的典型氣候特征。試驗地上年閑置,未施肥。土壤類型為砂質土,全鹽為0.1 g/kg,pH 8.52。1 m深土壤平均有機質為2.16～4.39 g/kg,全氮為0.20～0.55 g/kg,有效磷為1.30～9.34 mg/kg,速效鉀為56.8～85.7 mg/kg,堿解氮為4.79～10.19 mg/kg。

圖1 2019(左)和2020年(右)鹽池縣月平均氣溫、日照時數及降水量Fig.1 Monthly average temperature,sunshine duration and rainfall in Yanchi county in 2019(left) and 2020(right)

1.2 試驗設計

試驗設4個水分處理(W)和4個氮肥水平(N),裂區設計,主區設置水分處理,分次灌水,灌水定額為750 m3/hm2,用水表控制灌水定額。不同水分處理生育期內分別灌1水(W1,灌溉定額750 m3/hm2)、2水(W2,灌溉定額1 500 m3/hm2)、3水(W3,灌溉定額2 250 m3/hm2)和4水(W4,灌溉定額3 000 m3/hm2),各水分處理之間設置5 m 隔離區,于4月底灌第1水,之后大概每間隔1個月灌1次水。在各水分處理內,設置4個氮肥水平,3次重復,隨機區組排列。共48個小區,小區面積15 m2(5 m×3 m)。供試肥料為:尿素,含N 46%;磷酸二銨,含N 16%,含P2O544%;硫酸鉀,含K2O 50%。全生育期施基礎鉀肥100 kg/hm2,磷酸二銨100 kg/hm2,氮肥隨第2水一次性施入。因基肥磷酸二銨中含N 16%,實際氮肥用量為每個水平增加 N 16 kg/hm2,即N1:16 kg/hm2,N2:86 kg/hm2,N3:156 kg/hm2,N4:226 kg/hm2。于2019年4月中下旬移栽1 a生烏拉爾甘草實生苗,只進行水、肥處理,正常田間管理和農事操作,不測定性狀。2020年繼續同樣試驗處理,測定性狀。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標測定 于9月中旬進行甘草生長指標測定。每個小區隨機挖取5株,調查株高、側枝數、根長、根鮮質量、根干質量。株高(plant hight,PH):從植株基部至頂端的高度;側枝數(branch number,B):主莖萌發出的側枝數量;根長(root length,RL):從蘆頭至根尖頂端的長度;根鮮質量(root fresh mass,RFM):根部鮮物質質量;根干質量(root dry mass,RDM):根部烘干后的干物質質量。

1.3.2 有效成分含量測定 樣品制備:于甘草采收季10月中旬采收試驗處理的甘草植株根部,沖洗干凈,烘干,用GT 300 型球磨儀對樣品進行研磨,過60目篩。稱取樣品粉末0.1 g于10 mL容量瓶中,純甲醇溶解定容后,稱量,超聲(250 W,40 kHz)提取30 min,放冷,再稱量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,用微孔濾膜(0.22 μm膜)過濾,取濾液,即得。于 4 ℃中保存,備用。

甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)和甘草苷(liquiritin,L)含量測定:采用安捷倫1260液相色譜儀進行測定。色譜柱規格為C18,250 mm× 4.6 mm,流動相組成為0.1%甲酸水(A)和純甲醇(B)。甘草苷檢測波長276 nm,甘草酸檢測波長254 nm,柱溫40 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣量10 μL。梯度洗脫程序如表1。圖2為甘草苷、甘草酸(A)標準品及樣品(B)的色譜圖。

表1 甘草酸、甘草苷色譜條件Table 1 Chromatographic condition of glycyrrhizic acid and glycyrrhizin

圖2 甘草酸、甘草苷及甘草樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram chart of glycyrrhizic acid,liquiritin and licorice sample

總黃酮(total flavonoids,TF)提取與檢測:準確稱取0.250 g制備好的甘草樣品粉末于25 mL容量瓶中,用含0.2%氨水的80%乙醇溶液溶解定容,超聲提取( 250 W,40 kHz)90 min,用濾紙過濾,即得總黃酮提取液,重復3次。吸取提取液5 mL于25 mL容量瓶中,加入300 μL 5% NaNO2溶液,搖勻后靜置6 min,加入300 μL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻并靜置 6 min,再加入2 mL 4% NaOH溶液反應20 min,用 50% 乙醇定容,在510 nm測定吸光度,計算含量(%)。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 23.0統計軟件進行方差分析,用Origin 2021軟件繪圖,利用DPS 7.05軟件進行回歸模型的建立及Topsis綜合評價。

2 結果與分析

2.1 不同水氮組合對甘草生長的影響

由表2可知,灌水對株高具有極顯著影響 (P<0.01)(表2)。灌水處理下,平均株高為 55.54～65.21 cm,相對于W1,W2、W3和W4灌水條件下的株高分別增加17.4%、17.1%和 16.1%。施氮對株高具有極顯著影響。施氮處理下,株高隨著氮肥水平先增加后降低,表現為 N3>N4>N2>N1,N2、N3和N4相對于N1,增幅分別為7.3%、10.5%和9.0%。水氮交互作用對株高影響顯著(P<0.05)。水氮交互下,W2N4、W3N3、W2N3和W4N3的株高最高。

表2 不同水氮組合甘草生長性狀Table 2 Licorice growth traits under different water and nitrogen combination

灌水對側枝數影響極顯著。灌水處理下,側枝數隨著灌水定額的增加而增加,表現為W4>W3>W2>W1,相對于W1,W2、W3和W4灌水條件下的側枝數增幅依次為3.5%、10.2%和 20.0%。說明灌水可以增加側枝數。施氮對側枝數影響顯著。施氮處理下,側枝數隨著氮肥施用量增加而增加,至N4稍有所降低,相對于N1,N2、N3和N4增幅依次為6.4%、10.7%和 9.1%。水氮交互作用對側枝數影響不顯著。水氮交互下,W4N3、W4N2和W4N4的側枝數最多,分別為10.17、9.83和9.73。

灌水對根長具有極顯著影響。灌水處理下,平均根長為26.81～37.65 cm,均隨著灌水定額增加而增加,表現為W4>W3>W2>W1,相對于W1,W2、W3和W4灌水條件下的根長增幅依次為8.6%、12.7%和40.0%。施氮對根長影響顯著。施氮處理下,根長隨著氮肥水平先增加后降低,表現為N3>N4>N2>N1,相對于N1,N2、N3和N4增幅依次為3.6%、7.3%和3.5%。水氮交互作用對根長影響顯著。水氮交互下,W4中各氮肥處理根長均較長。

灌水對根鮮質量具有極顯著影響。灌水處理下,平均根鮮質量為17.24～21.01 g,相對于W1,W2、W3和W4灌溉定額分別使根鮮質量增加21.9%、19.7%和16.7%。施氮對根鮮質量具有極顯著影響。施氮處理下,根鮮質量隨著氮肥施用量先增加后降低,相對于N1,N2、N3和N4增幅分別為9.2%、15.9%和11.6%。水氮交互作用對根鮮質量影響顯著。水氮交互下,W3N3和W2N4根鮮質量最大。

灌水對根干質量影響極顯著(表2)。灌水處理下,平均根干質量為8.97～10.16 g,相對于W1,W2、W3和W4灌溉定額分別使根干質量增加了13.3%、12.8%和8.4%。說明灌水可以增加甘草根干質量。施氮對根干質量具有非常顯著影響。施氮處理下,根干質量隨著氮肥水平先增加后降低,相對于N1,N2、N3和N4增幅依次為11.7%、17.9%和10.2%。水氮交互作用對根干質量影響顯著。水氮交互下,W2N3、W2N4和W3N3的根干質量最大。

2.2 不同水氮組合對甘草根部有效成分含量的影響

對不同水氮組合下甘草根部有效成分甘草酸含量的研究表明,灌水對甘草酸含量具有極顯著影響(表3)。灌水處理下,甘草酸平均含量為 0.811%～1.206%,均隨著灌溉定額增加而升高,相對于W1,W2、W3和W4灌水條件下的增幅依次為15.2%、34.1%和48.8%。施氮對甘草酸含量具有極顯著影響。施氮處理下,平均甘草酸含量為0.962%～1.063%,相對于N1,N2、N3和N4增幅分別為9.1%、10.5%和0.2%。水氮交互作用對甘草酸含量影響顯著(P<0.05)。水氮交互下,W4N2和W4N3甘草酸含量最高。

表3 不同水氮組合下甘草根部有效成分含量Table 3 Active ingredients contents in root under different water and nitrogen combination %

灌水對甘草苷含量具有極顯著影響(表3)。灌水處理下,平均甘草苷含量為0.353%～ 0.655%,甘草苷含量均隨著灌水定額增加而升高,相對于W1,W2、W3和W4灌水條件下的增幅依次為35.8%、56.9%和85.5%。施氮對甘草苷含量影響不顯著。水氮交互作用對甘草苷含量影響極顯著。水氮交互下,W4N3、W4N4和W4N2甘草苷含量最高,分別為0.701%、0.670%和0.651%。

灌水對總黃酮含量具有極顯著影響(表3)。灌水處理下,總黃酮含量為5.566%～7.101%,相對于W1,增幅依次為-5.2%、15.4%和 21.0%。施氮對總黃酮含量具有極顯著影響。施氮處理下,平均總黃酮含量為6.101%～ 6.756%,為N3>N4>N2>N1,相對于N1,N2、N3和N4增幅依次為1.4%、10.7%和2.8%。水氮交互作用對總黃酮含量影響顯著。水氮交互下,W3N3、W4N1和W4N2總黃酮含量最高,分別為7.913%、7.331%和7.195%。

2.3 基于甘草酸、甘草苷及總黃酮含量的水氮因子優化

藥用成分含量的高低是評價甘草質量優劣的最重要指標。為進一步探明水氮組合與甘草酸、甘草苷及總黃酮含量之間的關系,以灌溉定額和氮肥施用量為自變量,甘草酸、甘草苷和總黃酮含量為因變量,進行回歸模擬分析,分別得到甘草酸、甘草苷和總黃酮與灌水定額(X1)和氮肥施用量(X2)、Y1、Y2和Y3的二次回歸方程式。對回歸方程的顯著性檢驗表明:甘草酸Y1和甘草苷Y2的P<0.01,達到極顯著水平,總黃酮Y3的P<0.05,達到顯著水平,說明方程的擬合度較好,能夠反映真實情況(表4)。

表4 灌溉定額、氮肥用量與甘草酸、甘草苷和總黃酮含量的回歸方程Table 4 Regression equation of irrigation quota,fertilization amount and glycyrrhizic acid,liquiritin and total flavonoids

由灌溉定額、氮肥施量與甘草酸含量的回歸模型可知,甘草酸含量隨著灌溉定額和氮肥施量的增加呈先增加后減小的趨勢,最高點坐標為 (3 000,108.86),此時對應甘草酸含量最高,為1.270%(圖3)。在灌溉定額、氮肥施量與甘草苷含量的回歸模型中,當灌溉定額為3 000 m3/hm2、純氮施量為134.20 kg/hm2時,對應的甘草苷含量最高,為0.670%,當純氮施量再繼續增加時,甘草苷含量又有所降低(圖4);在灌溉定額、氮肥施量與總黃酮含量的回歸模型中,當灌溉定額為3 000 m3/hm2、純氮施量為144.28 kg/hm2時,對應的總黃酮含量最高,為7.173% (圖5)。

圖3 水氮組合與甘草酸的回歸模型Fig.3 Regression model of water nitrogen combination and glycyrrhizic acid

圖4 水氮組合與甘草苷的回歸模型Fig.4 Regression model of water nitrogen combination and liquiritin

圖中*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。圓點顏色表示相關性值,大小表示相關性大小;圖中 PH、B、RL、RFM、RDM、GA、L和TF分別代表株高、側枝數、根長、根鮮質量、根干質量、甘草酸、甘草苷和總黃酮* indicates P<0.05;** indicates P<0.01;*** indicates P<0.001;color scheme indicates pearson correlation values.The size indicates the correlation.PH,B,RL,RFM,RDM,GA,L and TF indicate plant height,branch number,root length,root fresh mass,root dry mass,glycyrrhizic acid,liquiritin and total flavonoids圖6 甘草生長指標與活性成分的相關性Fig.6 Correlation coefficients between growth traits and active ingredients of licorice

2.4 基于Topsis 綜合評價的甘草高效水氮組合方案

利用Topsis 綜合評價法對基于甘草酸、甘草苷和總黃酮含量的各處理進行綜合評價,3個因變量指標權重都設為1,評價結果如表5所示。

表5 Topsis 綜合評判結果Table 5 Topsis comprehensive evaluation

根據Topsis 綜合評判結果C進行排序,W4N2排名第1,W4N3排名第2,即灌溉定額為3 000 m3/hm2,氮肥施量分別為86 kg/hm2和156 kg/hm2。而回歸分析優化得到的灌溉定額與Topsis綜合評價法的結果一致,氮肥施量范圍也正好在Topsis法評判的最優的兩個處理結果范圍內。進一步證實寧夏人工栽培甘草有效成分積累的最適宜的灌溉定額為3 000 m3/hm2,氮肥施量為108.86～144.28 kg/hm2。

2.5 甘草生長指標與有效成分的相關性

由圖 6 可知,株高(PH)、側枝數(B)及根長(RL)均與甘草酸(GA)、苷草苷(L)及總黃酮(TF)之間呈極顯著正相關關系(P<0.01);根鮮質量(RFM)與甘草酸(GA)、甘草苷(L)及總黃酮(TF)呈極顯著正相關關系(P<0.01);根干質量(RDM)與甘草酸(GA)呈極顯著正相關關系 (P<0.01),與甘草苷(L)及總黃酮(TF)呈顯著正相關關系(P<0.05)。株高、側枝數及根長與甘草有效成分含量相關性比較高,可作為甘草有效成分篩選的重要指標。

3 討 論

3.1 水氮組合對甘草生長的影響

氮素是植物生長發育過程中必需的大量元素之一,也是促進植物生長和提高作物產量的重要原因[15]。本研究中氮肥用量從16 kg/hm2(N1)增加到86 kg/hm2(N2)時,能夠使甘草株高、側枝數、根長、根鮮質量和根干質量分別增加 7.31%、6.40%、3.63%、9.24%和8.69%,說明氮素在促進植株生長方面發揮了重要作用。但是氮素供給與植物生長需求并非呈直線關系,氮素過多會造成氮肥利用率下降,產投比降低[16]。如N3(156kg/hm2)相對于N1,能夠使甘草株高、側枝數、根長、根鮮質量和根干質量分別增加 10.52%、10.68%、7.25%、15.91%和15.41%,但N4(226 kg/hm2)相對于N1,能夠使甘草株高、側枝數、根長、根鮮質量和根干質量分別增加 9.01%、9.13%、3.49%、11.59%和9.24%,反而有所下降,原因可能是在N4處理下,由于氮濃度過高,試驗區土壤中的氮處于“極豐”狀態,超過了甘草生長所需要的范圍,冗余的氮則留在了土壤中。這與前人對三七[17]、何首烏[18]的研究結論一致。

水也是植物生長發育及新陳代謝不可或缺的部分,植物必須有足夠的水分才能完成各種生理生化過程,最終形成產量[19]。本研究灌溉定額從750 m3/hm2(W1)增加到1 500 m3/hm2(W2)時,能夠使甘草株高、側枝數、根長、根鮮質量和根干質量分別增加17.41%、3.49%、8.58%、 21.85%和10.66%,說明灌水能夠使植株生長茂盛,根系發達。但水分也并非越多越好,本研究W3(灌溉定額2 250 m3/hm2)相對于W1處理,株高、根鮮質量和根干質量分別增加17.08%、19.71%和10.12%,W4(灌溉定額3 000 m3/hm2)處理相對于W1,株高、根鮮質量和根干質量分別增加16.14%、16.75%和6.40%,稍有所下降。但側枝數和根長,均是隨著灌溉定額的增加有所增加,說明水分對甘草各生長指標的影響也有一定的適宜范圍。

氮素和水對作物的生長發育及產量的形成是相輔相成,又相互影響的[20]。適量的氮肥可以促進植物根系生長,有利于根系吸收土壤深層的水分,從而提高植物的水分利用效率。但施氮過量時,會導致氮利用效率降低,對水分利用效率沒有促進作用。水分則影響植物對氮的吸收、同化、利用及轉運分配[21]。本研究結果表明,W2N4和W3N3的株高、根鮮質量及根干質量的值最大,W4N3和W4N2側枝數最多,W4水分處理下的根長均較長,說明適宜的水氮配比能夠促進植株生長,利于根部干物質積累,水分對根系的伸長至關重要。這也證實了一定水分范圍內,根系生長與土壤水分狀況之間呈正相關關系,當土壤水分較少時,植物根系會尋找更多的水源,增加地上部向地下部運輸的同化物質量,從而根系生長快于地上部分[22]。

3.2 水氮組合對甘草有效成分含量的影響

中藥材的活性成分主要是藥用植物積累的次生代謝產物,其含量高低與栽培環境密切相關,通過調整栽培措施,可以有效改善藥材質量,提高產量及藥效成分[23-25]。研究表明,不同地區生長的甘草的甘草酸及甘草苷含量有很大差異[26],這與當地的栽培條件密切相關。施用300 kg/hm2磷酸二銨與不施用相比,可以使甘草經濟產量增加37.99%,生物產量增加43.02%,有效成分含量增加80.80%,經濟效益增加62.45%[27]。目前生產上商品甘草多以烏拉爾甘草為主,因其產量高,品質好,深受市場喜愛。本研究中,氮肥用量從N1增加到N2,烏拉爾甘草中甘草酸、甘草苷及總黃酮含量分別增加9.05%、6.09%和 1.35%,說明使用氮肥可以提高甘草有效成分含量。當氮肥用量從N3增加到N4,甘草酸、甘草苷及總黃酮含量均下降。說明氮肥用量應控制在合理范圍內,施用過多不但會影響有效成分的積累,還會造成經濟效益及生態效益的降低。

前人研究表明,適度的干旱脅迫有利于甘草活性成分的積累[28]。本研究中,隨著灌溉定額的增加,甘草酸、甘草苷及總黃酮含量均呈現增加的趨勢,W4相比于W1,3種成分含量分別增加 48.75%、85.47%和20.99%,說明灌水對于甘草有效成分含量的積累具有直接的促進作用。該結果與前人結論中適度干旱促進活性成分積累的觀點有所差別,主要原因是本試驗立足于寧夏中部干旱帶鹽池縣沙生土壤,此區域為全國西鎮甘草的主產區,所產甘草色紅皮細,品質優良,深受市場歡迎。但該區域氣候比較干旱,地下水位較低,降雨量少,缺水是制約當地農業的瓶頸問題。甘草根系發達,生命力頑強,耐逆性強,適宜在這樣的生境生存。本研究結果表明在W4灌溉定額下,甘草的水分利用效率較高,有效成分含量積累較快。

3.3 基于甘草有效成分含量的灌水和施氮方案

中藥材的藥用成分是植物與生長環境相互作用過程中,積累的能夠提高自身保護和生存競爭力的次生代謝產物[29]。相對于農作物而言,中藥材更注重于質量的提升,而衡量中藥材質量好壞的依據,即藥用成分含量。合理的水肥方案,能夠促進有效成分積累,提高藥材質量[30]。本研究利用二次回歸模型研究因變量灌水、施氮與甘草中甘草酸、甘草苷及總黃酮含量之間的關系,擬合出灌溉定額為3 000 m3/hm2,氮肥施量為108.86～144.28 kg/hm2時,3種成分含量均達到最高,分別為1.270%,0.670%,和7.173%。此結果與前人[11,24]研究結論中氮肥效應的結果一致,即中等氮肥條件下有利于甘草活性成分的積累。高灌溉定額3 000 m3/hm2最有利于活性成分積累的結論,與試驗區干旱的土壤水分狀況,及砂性土壤不保水的特點相吻合。由于該地區屬干旱地帶,供水能力有限,3 000 m3/hm2已是最大用水限額,因此,灌溉定額最大只設定到3 000 m3/hm2。說明該地區對水分的需求量比較大,研究結果與當地的實際情況一致。該研究中甘草酸含量最高僅為1.27%,并未達到《中華人民共和國藥典》規定的2.0%的標準,因在寧夏栽培模式下,人工甘草需移栽培3 a以上,而本研究是對移栽2 a的甘草所做的成分檢測。