高良姜黃酮醇合成酶基因的生物信息學分析

【摘 要】

在前期建立的轉錄組數據中注釋獲得高良姜黃酮醇合成酶（flavonol synthase， FLS）編碼基因序列，通過生物信息學分析軟件對該基因及其編碼蛋白進行序列分析，探討其編碼蛋白的理化性質、親/疏水性、高級結構、保守功能域以及系統發育關系，并運用fragments per kilobase of exon per million reads mapped （FPKM）法計算該基因在高良姜不同組織中的表達差異。獲得的高良姜FLS基因含有1005 bp的開放閱讀框，編碼含有334個氨基酸的蛋白質。編碼蛋白的序列分析發現，高良姜FLS蛋白分子量約為38.2 kDa，屬于親水性、混合結構型蛋白，不含有跨膜結構域并定位在細胞質；具有黃酮醇合成酶保守功能域。FLS基因在高良姜不同組織中的表達趨勢為根莖>莖>葉片。上述結果可為后續利用該基因調控高良姜黃酮醇類成分的生物合成奠定基礎。

【關鍵詞】 高良姜；黃酮醇合成酶；生物信息學

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）06-0027-04

Bioinformatics Analysis of Gene Encoding Flavonol Synthase from Alpinia officinarum

HUANG Qionglin

Guangdong Medical University， Zhanjiang 524023， China

Abstract：

To analyze cDNA sequence feature of FLS gene and the function of its coding protein from traditional Chinese medicine Alpinia officinarum， a FLS gene was annotated from the transcriptome of A.officinarum and then analyzed using bioinformatics approaches. The results revealed that acquired FLS gene contained an open reading frame with a length of 1005 bp and encoded 334 amino acids. The FLS protein was a hydrophilic and hybrid protein and its molecular weight was 38.2 kDa. The FLS protein did not contain transmembrane domain and locate in cytoplasm. The FLS protein also contained a flavonol synthase functional domain and belonged to flavonol synthase superfamily. The FLS gene expressed highest in rhizome， and followed by stem， and least in leaf of A.officinarum. The results would provide a firm foundation for the biosynthesis of the medicinal flavonol in A.officinarum.

Keywords：AlpiniaofficinarumHance; Flavonol Synthase; Bioinformatics

高良姜是嶺南地區道地中藥材，也是民間常用調味劑和湯料，來源于姜科多年生植物高良姜Alpiniaofficinarum Hance的干燥根莖，具有散寒止痛、溫中止嘔的功效［1］。據資源［2-3］調查，高良姜野生資源已幾乎滅絕，人工栽培的規模和產量也在逐年下降，部分產區已經出現供不應求的趨勢。黃酮類是高良姜發揮藥效作用的物質基礎。高良姜含有高良姜素、高良姜素-3-O-甲醚、山萘酚、槲皮素等黃酮醇成分，這些成分具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理活性［4］。鑒于高良姜的藥效成分較為明確，開展基于黃酮醇生物合成的基因調控研究，是促進高良姜有效成分積累和資源可持續利用的可考慮途徑之一。

黃酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）是植物類黃酮生物合成途徑的關鍵調控酶之一，能使二氫黃酮C3位發生羥基化，進而催化成一系列黃酮醇類化合物［5-6］。FLS編碼基因的表達已被證實對黃酮醇含量具有正調控作用［7-8］。當前，青天葵［9］、杜仲［10］、金銀花［11］等藥用植物FLS基因已得到克隆。

本研究從轉錄組測序數據中挖掘和鑒定高良姜FLS基因，使用生物信息學方法進行該基因及其編碼蛋白的序列特點分析和功能預測，并采用fragments per kilobase of exon per million reads mapped （FPKM）法探討其在高良姜中的表達模式，以期為利用基于FLS基因的基因工程途徑調控高良姜黃酮醇的生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 基因序列 在前期研究中，作者分別以高良姜葉片、莖和根莖為材料進行了轉錄組高通測序，并通對序列組裝獲得了147652條非冗余基因（unigene）［12］。本研究以“flavonol synthase”為檢索詞，在上述獲得的unigene中搜索編碼高良姜FLS的基因序列。

1.2 生物信息學分析 采用公共生物信息學數據庫（見表1）進行高良姜FLS結構和功能的預測和分析。

1.3 高良姜FLS基因的表達分析 采用FPKM法計算FLS基因在高良姜葉片、莖和根莖中的表達量，其計算公式為：高良姜FLS基因表達量=（FLS基因的fragment數×109）/（FLS基因序列長度×樣品fragment總數）。

2 結果與分析

2.1 基因序列 在高良姜轉錄組數據中檢索到一條長度為1050 bp的高良姜FLS基因cDNA序列，將其命名為AoFLS，其中包含1002 bp編碼區、35 bp 5端非編碼區和10 bp 3端非編碼區。AoFLS開放閱讀框（open reading frame， ORF）長度為1005 bp，編碼334個氨基酸。

2.2 編碼蛋白AoFLS的功能域分析 如圖2所示，AoFLS含有3個功能域，分別是1個特異性功能域——α-同戊二酸依賴性雙加氧酶（α-oxoglutarate-dependent dioxygenase，2OG-FeII_Oxy）、2個非特異性功能域——黃酮醇合成酶（flavonol synthase）和異青霉素N合成酶及相關雙加氧酶（Isopenicillin N synthase and related dioxygeneases），說明AoFLS具有黃酮醇合成酶的功能。因此，AoFLS確定為高良姜黃酮醇合成酶基因，其編碼蛋白即高良姜黃酮醇合成酶。

2.3 編碼蛋白AoFLS的理化性質分析 AoFLS的分子量為38.2 kDa，等電點為6.15，屬于酸性蛋白質。在氨基酸組成上，含量較為豐富的是賴氨酸（Lys）和谷氨酸（Glu），所占比例均為9.0%。蛋白質不穩定指數為39.94，小于40，說明其為穩定蛋白質。

2.4 編碼蛋白AoFLS的親/疏水性分析 如圖3所示，AoFLS多肽鏈第175位的絲氨酸具有最高的分值0.820，此處表現出最強的疏水性；位于第316位的苯丙氨酸顯現最低分值-2.653，此處為親水性最強。從整條多肽鏈來看，AoFLS整體表現為親水性，而且不存在明顯的疏水區域，說明其為親水性蛋白質。

2.5 編碼蛋白AoFLS的跨膜結構和亞細胞定位分析 從圖4所示的跨膜結構域分析結果可知，AoFLS的整條多肽鏈位于細胞膜外的概率均高于整條多肽鏈位于細胞膜內或部分氨基酸存在跨膜結構的概率，說明該蛋白不含有跨膜結構。另外，亞細胞定位分析顯示，AoFLS蛋白位于細胞質的積分值為10.00，位于細胞核、細胞外、葉綠體等位置的積分值均為0，表明AoFLS蛋白定位在細胞質上。

2.6 編碼蛋白AoFLS的二級結構分析 如圖5所示，組成AoFLS二級結構的元件有α-螺旋、隨意卷曲、延伸鏈和β-轉角等四種，各自的比例分別是34.73%、42.51%、17.37%和5.39%，說明AoFLS蛋白具有以α-螺旋和隨意卷曲為主要組成元件的混合型結構。

2.7 AoFLS基因表達分析 基于FRKM法計算AoFLS在高良姜不同組織中的相對表達量，結果如圖6所示，該基因在根莖中的表達最高，其次是莖，在葉片中的表達則最少。

3 討論

黃酮醇合成酶不僅決定植物黃酮醇類物質的合成與積累，還影響植物花色的形成、種子數量等生理過程，是植物生長發育的關鍵調控節點［13-14］。因此，開展FLS基因及其編碼蛋白功能和調控研究對高良姜黃酮醇成分的合成及其品種優育有著重要的促進作用。

本研究在高良姜轉錄組數據的基礎上鑒定出了AoFLS基因，獲得了其1002 bp的編碼區序列及編碼334個氨基酸的蛋白質序列。AoFLS蛋白含有黃酮醇合成酶的典型功能域并歸屬于黃酮醇合成酶超級家族，說明其具有催化黃酮醇化合物合成的功能。此外，本研究還發現AoFLS為親水性混合結構型蛋白質，不含有跨膜結構域并且定位在細胞質。這些結論為后續高良姜FLS蛋白的分離、功能鑒定和調控研究提供了參考依據。

FRKM法是在分析高通量測序數據時常用的一種基因相對表達量計算方法，它對測序長度和基因長度進行歸一化處理，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達水平具有可比性［15-16］。FRKM法分析顯示，AoFLS在高良姜不同組織中均有表達，并且在根莖中表達最高，提示高良姜黃酮醇的合成可能在根莖中更為活躍，這也與高良姜以根莖入藥的事實相符。

本研究基于轉錄組測序數據中鑒定出高良姜FLS基因，進行了其編碼蛋白的序列分析和功能預測，明確該基因在高良姜的表達模式，為后續利用FLS基因調控高良姜黃酮醇類藥效成分的合成，促進其資源可持續利用奠定了基礎。

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（收稿日期：2022-07-27 編輯：陶希睿）