養正消積膠囊通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導肺腺癌細胞凋亡和自噬的作用研究

周菁,王玉珍,李麗娜,郭亞煥,史玉民,焦咪,段煉,閻麗,王佳

(1.陜西省腫瘤醫院腫瘤內科;2.空軍軍醫大學附屬西京醫院泌尿外科,陜西 西安 710000)

肺癌具有高發病率和高死亡率,主要有非小細胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞癌兩種類型,以NSCLC最為常見[1]。NSCLC患者主要為肺腺癌,此類患者在疾病早期通常無典型表現,但具有高轉移潛能。調查[2]發現,在確診為肺腺癌患者中,70%的患者已進展為中晚期,錯失最佳治療時機。通過手術、放療、化療、靶向、免疫等手段的應用,晚期患者生存率提高有限[3-4]。臨床研究[5]已證實,中醫在惡性腫瘤的臨床治療中具有安全性高、藥物副作用小等突出優勢。養正消積膠囊是一種由16味中藥組方構成的方劑,可從多種途徑誘導腫瘤的凋亡和自噬,進而抑制腫瘤的進展[6]。研究[7-8]發現,PI3K/AKT/mTOR信號通路是調控細胞增殖、凋亡的重要通路。本課題組通過網絡藥理學相關數據庫應用,發現養正消積膠囊可能是通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制肺腺癌的發展,故對肺腺癌A549細胞進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細胞(中國科學院細胞庫),取對數生長期細胞用于實驗。養正消積膠囊購自石家莊以嶺藥業股份有限公司。高糖DMEM培養基(美國Gibco公司);胎牛血清(上海源葉生物科技有限公司);β-actin單克隆抗體(美國Abcam公司);p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅰ、ILC3Ⅱ單PI3K、AKT、mTOR、克隆抗體(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 主要儀器

CyFlowCounter型流式細胞儀(德國Partec公司)、5427R型低溫高速離心機(德國Eppendrof公司)、HF240型細胞培養箱(上海力申科學儀器公司)、TE22型轉膜儀、SE300型電泳儀(均購于美國Hoefer公司)、SpectramaxM3型多功能酶標儀(美國BioTek公司)、Mini-PROTEANTetra System型垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 養正消積膠囊化學成分及靶點預測 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)中分別輸入養正消積膠囊的主要成分黃芪、莪術、白花蛇舌草、半枝蓮進行檢索并整理,獲得活性化合物和作用靶點,使用R語言將與藥物活性成分相關的靶點和疾病靶點進行匹配映射,且繪制韋恩圖(Venn),將獲得的潛在抗肺腺癌的作用靶點,構建養正消積膠囊靶點蛋白相互作用網絡,進行KEGG通路分析和基因本體(GO)富集分析。

1.3.2 養正消積膠囊提取物制備 將養正消積配方粉添加至純DMSO溶液中,并在4 ℃條件下靜置12 h,離心機100 r/min離心20 min后過濾上清液。用平衡鹽溶液稀釋提取物,使用分光光度計在波長405 nm波長下進行光密度定量化,以透光度0.25的溶液作為標準實驗用藥,將養正消積膠囊提取物命名為DME25用于后續實驗。

1.3.3 細胞培養及分組 將DMEM(含有濃度為10%的胎牛血清、濃度為1%雙抗)培養基于培養箱(37 ℃、5% CO2)中對人肺腺癌A549細胞進行培養,觀察每日的生長情況。依據不同濃度將細胞分為空白對照組、DME25高(1∶200)、中(1∶1 000)、低(1∶5 000)濃度組。

1.3.4 CCK-8法測定DME25對人肺腺癌A549細胞增殖能力 將A549細胞(1×104個細胞/孔)接種到96孔板中,然后用不同濃度的DME25(1∶200、1∶1 000、1∶5 000)處理48 h。將10 μL CCK-8溶液添加到96孔板中。溫育3 h后,采用酶標儀檢測細胞吸光度值。

1.3.5 細胞劃痕實驗 將濃度為1×105個/mL的A549細胞接種至12孔板。細胞貼壁后,10 μL槍頭垂直于培養板背面劃痕,PBS清洗3次,將細胞隨機分為4組:對照組、DME25低、中、高濃度組,給予對應濃度藥液處理后繼續培養,分別于0、12、24 h時拍照觀察。并繪制24 h時各組細胞遷移距離的柱狀圖。實驗至少重復3次。

1.3.6 Transwell侵襲實驗 將100 μL Matrigel用DMEM培養基稀釋后,加入Transwell上室。取不同濃度DME25干預24 h的對數生長期A549細胞,消化后放入不含胎牛血清的DMEM培養液中。將細胞濃度調整為5×104個/mL的細胞接種至Transwell上室,混有血清和細胞的培養基緩慢加入下室。在37 ℃、5% CO2小室內培養24 h后取出,細棉簽輕擦小室內部未穿膜的細胞,固定20 min(固定物:4%多聚甲醛),染色20 min(染色物:結晶紫),顯微鏡下拍照計數。

1.3.7 流式細胞術檢測A549細胞凋亡率 將對數生長過程的A549細胞,按照每個孔4×105/個接種于6孔板內。在37 ℃的培養環境下培養24 h,待細胞貼壁生長后,向實驗組中加入提前配好的不同濃度DME25溶液,置于培養箱中培養48 h。收集上述處理后的細胞,用提前預冷的無菌PBS溶液洗滌后加入1×Binding緩沖液100 μL,隨后加入Annexin V-FITC溶液和碘化丙啶溶液各5 μL。細胞放置在避光黑暗處,輕輕震蕩10 min后加1×Binding緩沖液400 μL搖勻,上機檢測細胞凋亡率。

1.3.8 Western blot檢測PI3K激活劑對各組細胞中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達的影響 在6孔板內接種將密度為5×105個/mL的A549細胞,貼壁生長融合≥75%時,將濃度相當的DME25干預細胞加入,在培養箱(37 ℃、5%CO2)中培養48 h后收集細胞。各組細胞總蛋白的提取使用蛋白提取試劑盒,BCA試劑盒檢測蛋白濃度。100 ℃下將混合均勻蛋白樣品液與緩沖液變性5 min,進行SDS-PAGE分離蛋白、轉膜、封閉,加一抗(1∶1 000稀釋的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1抗體與β-actin抗體),于4 ℃孵育過夜,將二抗加至洗滌后的TBST,室溫避光孵育2 h,TBST洗膜、顯影,顯影設備為化學發光顯影試劑盒,β-actin為內參,分析DME25對上述蛋白表達水平的影響。此后將細胞分為兩組,一組加中濃度DME25干預,一組加入PI3K激活劑740Y-P干預,置于培養箱(37 ℃、5%CO2)培養48 h后收集提取蛋白,Western blot法檢測各組細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 運用網絡藥理學相關數據庫研究養正消積膠囊治療肺腺癌的潛在作用靶點及機制

通過TCMSP平臺數據庫的檢索養正消積膠囊組份中重要的4種中藥,其中黃芪化學成分87個,莪術81個,半枝蓮94個,白花舌蛇草37個。通過OB>30%和DL>0.18篩選得到這4種藥物的潛在活性成分莪術3個,黃芪18個,白花舌蛇草7個,半枝蓮26個。

采用Genecard、GAD和Omim數據庫平臺,檢索關鍵詞“lung adenocarcinoma”,共得到肺腺癌的潛在作用靶點8 685個,靶基因中歸屬于黃芪的152個,莪術9個,白花舌蛇草135個,半枝蓮164個,與肺腺癌基因取交集后共同靶點為8個。將黃芪-莪術-白花舌蛇草-半枝蓮與肺腺癌相關的關鍵靶點基因導入Cytoscape軟件,進行網絡構建及可視化,得到養正消積膠囊治療肺腺癌的有效活性成分。將黃芪-莪術-白花舌蛇草-半枝蓮治療肺腺癌的潛在的關鍵靶基因導入String數據庫平臺,獲取各蛋白質之間的關系,采用該平臺繪制蛋白關系網絡,根據Degre≥24的節點制作出前20個關鍵蛋白質節點分別為MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14、FOS、IL6、RXRA、MAPK8、EGFR、CCND1、RB1、CXCL8、PRKCA、CDKN1A、MYC。后續的GO富集分析結果顯示,養正消積膠囊與肺腺癌相關的關鍵生物學功能主要為細胞對化學應激的反應、對氧化應激的反應、對藥物的反應、對凋亡信號通路的負向調節、對缺氧的反應、凋亡信號通路的負調控、凋亡信號通路的調控等。KEGG通路富集分析顯示相關靶點主要富集的通路為脂質與動脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白糖、IL-17信號通路、TNF信號通路等,提示上述通路可作為研究養正消積膠囊抗肺腺癌療效的重要方向。見圖1。

2.2 CCK-8法測定DME25對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

與對照組相比,低、中、高濃度DME25處理的A549細胞增殖能力下降,濃度越高細胞增殖能力越弱,且不同濃度組間細胞增殖能力比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 DME25對人肺腺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響

DME25處理后,細胞遷移、侵襲能力較對照組弱,且高濃度組<中濃度組<低濃度組<對照組(P<0.05)。見圖3及圖4。

2.4 DME25對人肺腺癌A549細胞凋亡的影響

與對照組相比,DME25低、中及高濃度組中A549細胞的凋亡率均增高(P<0.05),且濃度越高,凋亡率越高。見圖5。

2.5 DME25對人肺腺癌A549細胞自噬的影響

Western blot結果顯示,A549細胞經DME25干預24 h后,自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達水平升高,同時促進LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ轉化,且Beclin-1蛋白水平也升高(P<0.05)。見圖6。

2.6 DME25對PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比,經DME25干預對數生長期的A549細胞24 h后,DME25能降低p-P13K、p-mTOR和p-AKT蛋白的水平(P<0.05),而DME25對P13K、AKT、mTOR蛋白的表達無影響。見圖7。

2.7 PI3K激活劑740Y-P對PI3K/AKT/mTOR信號通路及自噬相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比,加入50 μg/mL 濃度的740Y-P(PI3K激活劑)培養8 h后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達均增多,Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ表達減少、LC3Ⅰ比值均降低(P<0.05)。見圖8。

3 討論

養正消積膠囊是一種由黃芪、莪術、白花舌蛇草、半枝蓮等16味中藥材共同組成的中藥補益劑,具有扶正祛邪、解毒化瘀及健脾益腎等功效,對多種惡性腫瘤均具有良好的治療效果[9-10]。養正消積膠囊的藥理作用機制研究[11]顯示,該藥可通過作用于FAK、PI3K/Akt、HSP27及其受體c MET等來起到抑制腫瘤進展的作用。一項納入11項研究的meta分析報告[12]顯示,與單純化療相比,養正消積膠囊與化療聯合治療非小細胞肺癌效果更優,且可減輕化療毒副反應。陳曉萌等[13]研究也證實了養正消積膠囊對原發性肝癌具有明確的治療效果,且安全性較高。研究[14]發現,當細胞的凋亡受到抑制時,便會導致腫瘤的發生和進展。本研究發現,養正消積膠囊中四種中藥黃芪、莪術、白花舌蛇草、半枝蓮與肺腺癌密切相關的有效化合物槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、漢黃芩素等,通過MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14等基因,影響細胞對化學應激的反應、對氧化應激的反應、對藥物的反應、對凋亡信號通路的負向調節,可能是通過流體剪切應力、脂質與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt及MAPK信號通路、癌癥中的蛋白糖、IL-17及TNF等信號通路發揮作用。進而制備養正消積膠囊的提取物加入肺腺癌A549細胞后,通過表型實驗發現,與對照組相比,DME25可降低A549細胞的增殖及遷移侵襲能力,提高細胞凋亡率,提示DME25對肺腺癌具有明確的治療效果。

細胞自噬指的是通過基因調控細胞自行結束生命的行為,與細胞穩態、發育及免疫反應等多個生物學過程相關,是目前新發現的癌癥治療靶點。LC3為細胞自噬活性的標志性蛋白,其亞型有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。在自噬發生時,LC3-Ⅰ可轉化為LC3-Ⅱ,故可通過LC3-Ⅱ/LC3-1值的高低來評估細胞的自噬水平[15]。現已證實[16],自噬相關基因Beclinl主要誘導自噬的啟動,是調節細胞正向自噬的最重要因子。研究顯示,A549細胞經DME25干預24 h后,自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達水平升高,同時促進LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ轉化,即ILC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高,且Beclin-1蛋白水平也升高,提示養正消積膠囊可對腫瘤細胞的自噬過程也有著一定的促進作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是對腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為均有一定調節作用的信號通路。王軍等[17]研究亦證實,抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路可促進人結腸癌SW480細胞的凋亡和自噬。本研究顯示,經DME25干預的各組A549細胞中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白含量均低于對照組,Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值亦低于對照組,且呈劑量依賴性,提示DME25可能是通過下調A549細胞中PI3K、AKT磷酸化水平,促進細胞自噬,進而抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的促癌作用。

綜上,養正消積膠囊養通過下調肺腺癌A549細胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平,促進細胞自噬,抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的促癌作用。