蠶絲-PLGA復合工程支架在大鼠肌腱損傷中的修復作用

梁永超,劉偉亮,王春龍,馮海蓮,王嬌

(1.秦皇島市第三醫院外三科;2.通用環球中鐵山橋醫院骨外科; 3.秦皇島市婦幼保健院手術室;4.通用環球中鐵山橋醫院手術室,河北 秦皇島 066000)

肌腱損傷是常見的運動性損傷,可導致患肢疼痛及功能障礙,對患者生活質量有嚴重影響[1]。肌腱損傷后自我修復、愈合緩慢,損傷后的修復仍是臨床難題[2]。臨床常使用肌腱修復縫合術(完全斷裂)或石膏/夾板固定、理療、鎮痛消腫等非手術手段(部分斷裂)進行傳統治療,盡管有一定的臨床價值,但其療效仍未達理想,患者治療后肌腱功能難以恢復至受損前水平[3]。因此,關于肌腱缺損組織工程化研究一直是現今研究的重點、熱點。支架材料是主要限制組織工程研究結果應用于臨床的因素之一[4],故而研制生物力學性能、生物相容性更好的新型支架材料具有重要價值。

聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)的生物相容性、可降解性俱佳,是常用的高分子材料[5]。當前領域中將蠶絲和PLAG材料復合制備組織工程支架已有報道,其生物相容性已被證實[6-7],但將其應用于肌腱修復方面尚無報道。本研究擬探討蠶絲-PLGA復合材料制備的工程支架對肌腱損傷中的修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠48只(北京維通利華),6～8周齡,體重200～220 g。均適應性飼養1周,通風良好,溫度:25 ℃,相對濕度:50%,不限制飲食、飲水。本實驗已通過倫理審批(編號:20200801)。

1.2 材料與試劑

蠶絲由河北秦皇島蠶農贈送,PLGA細絲(GA∶LA=90∶10,上海天清),單絲直徑17 μm,每束含12根單絲,色乳白,質柔軟。LG-DMEM(Gibco),胎牛血清(FBS,杭州四季青),胰蛋白酶(Sigma),24、96孔塑料培養板為Costar產品。

1.3 蠶絲-PLGA支架的制備

500 mL Na2CO3溶液(0.3%)中添加1 g蠶絲,煮沸兩次,30min/次,去除絲膠,獲取蠶絲絲素纖維,清洗、晾干、備用。制作蠶絲-PLGA支架,編織次序為:取蠶絲絲素纖維單絲(160根)、PLGA細絲單絲(96根)混合均勻(質量比為2∶3),平行排列(記為×1),將其按順時針(記為×2)-逆時針(記為×4)-順時針(記為×8)-逆時針(記為×16)-順時針(記為×32)-逆時針(記為×48)的次序進行扭合,每次均由2捻扭合成1小索,即完成蠶絲-PLGA混合編織支架(包含兩種單絲共12 288根)。75%乙醇消毒30 min后,充分清洗、晾干。術前,將蠶絲-PLGA支架剪成5 mm×2 mm×1 mm,采用無菌PBS溶液浸泡過夜。

1.4 大鼠肌腱損傷模型的建立、分組及處理

將48只雄性SD大鼠按隨機數字表法分成實驗組和對照組,每組各24只。實驗組與對照組參照文獻[8]方法造模,予以水合氯酸溶液(0.3～0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉,麻醉后,將大鼠擺放呈俯臥位,固定四肢,備皮,先用碘伏消毒,然后酒精脫碘。于后肢外側作切口,分離周圍的組織,暴露跟腱,盡量避免對營養血管造成損傷,小心分離排腸肌內側頭肌腱。實驗組在跟腱離斷后,將蠶絲-PLGA支架植入大鼠肌肉,與腱組織緊密貼合,然后縫合皮膚。對照組在跟腱離斷后,僅進行皮膚切口的縫合,不作任何修復。

1.5 取材

分別于術后1、2、3、4周進行取材,每次每組取6只大鼠。解剖以顯露術區,進行大體觀察。并對肌腱損傷組織進行解剖,對損傷處的愈合情況以及生物膜吸收情況進行觀察。采集損傷的肌腱組織,用無菌PBS進行清洗后,以4%多聚甲醛予以固定處理,置于-4 ℃下保存,用于后續測定。

1.6 HE染色組織學評價

待測組織用4%多聚甲醛固定,依次完成脫水、透明、浸潤、包埋操作,切片(4～10 μm),HE染色,利用電鏡下觀察樣本中膠原纖維成熟等情況。

1.7 免疫組化檢測膠原蛋白III的表達

待測組織用4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脫水、清洗,予以石蠟包埋,切片(5μm),HE染色,使用免疫組化法檢測樣本膠原蛋白III表達水平。

1.8 生物力學測試

取各組組織標本,通過單軸拉伸測試其最大拉伸應力。新鮮取材的組織先測其橫截面積,將材料修剪成長條型,兩端夾具固定,沿長軸方向均勻的對樣品進行力學加載,拉伸速度為5 mm/min,記錄最大拉力載荷。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 大體觀察

造模后1 d,實驗組與對照組即恢復自主進食,能夠正常走動跳躍,行為未受影響,但均存在不同程度攝食減少;所有大鼠術后均未見紅腫感染。

術后1周,實驗組采用血管鉗進行切口鉗鈍性分離、顯露深層組織,可見皮膚、周圍存在水腫,肌腱修復區愈合不牢,予以輕微牽拉便可見組織分離,能夠清晰辨認生物支架,與肌腱組織易分離;對照組同樣存在周圍組織水腫。術后2周,實驗組切口愈合良好,通過銳性切開顯露術區,組織水腫減輕,生物支架與肌腱貼合緊密;對照組的肌腱損傷處和周圍組織輕微黏連,但可經輕微鈍性分離。術后3周,實驗組切口基本愈合,生物支架與肌腱貼合致密,無法完整分離,且生物支架可見液化降解跡象,肌腱活動良好;對照組肌腱損傷處和周圍組織之間存在明顯粘連帶。術后4周,實驗組生物支架降解吸收,肌腱損傷處和周圍組織基本融合,肌腱活動正常;對照組損傷的肌腱損傷處和周圍組織明顯粘連,肌腱活動比較差。

2.2 組織學評價

術后1周,實驗組與對照組肌腱周圍組織均存在大量淋巴細胞,同時可見少量中性粒細胞,無巨噬細胞,伴隨少量成纖維細胞。術后3周、4周,實驗組術區支架外可見成纖維細胞大量聚集,可見膠原纖維排列緊密、規則,瘢痕組織形成,肌腱細胞生長入支架內;對照組肌腱損傷處成纖維細胞大量聚集,浸潤至正常細胞,膠原纖維排列松散、不整齊。見圖1。

2.3 兩組膠原蛋白III表達比較

與對照組比較,實驗組術后2、3、4周后膠原蛋白III表達水平均增高(P<0.05)。見表1。

表1 3組膠原蛋白III表達水平比較

2.4 兩組生物力學評價比較

與對照組比較,實驗組術后2、3、4周的肌腱最大拉力載荷均增大(P<0.05)。見表2。

表2 3組肌腱最大拉力載荷比較

3 討論

近年來,隨著組織工程醫學的持續發展,利用組織工程技術將有生命的種植體植入到損傷區域以加快肌腱損傷修復,正成為當前肌腱損修復研究領域的新思路[9-10]。但目前組織工程的實際應用仍存在較大挑戰,支架材料是主要限制因素之一,尋找適宜的支架材料是當前階段的重點。PLGA是一種降解速度可控,機械性能及柔韌性均優異的組織工程肌腱支架[11]。蠶絲的機械性能則因含有支鏈含有生長因子、黏附因子而獨具優勢,在醫療領域應用廣泛。既往研究[12]發現,蠶絲可明顯吸附肌腱細胞,且生物相容性、力學性能均顯示良好,具有促進肌腱損傷修復、改善修復效果的巨大潛能。復合材料可有效結合天然材料、人工合成材料的優勢,打破其局限性,從而改進材料性能。Sahoo等[13]發現細胞適應材料伸展,呈梭形,并與支架材料呈大致平行的排列方式。當前領域中將蠶絲和PLAG材料復合制備組織工程支架已有報道,其細胞毒性、生物相容性亦被實驗一一證實,但將其在肌腱修復應用方面尚無論據。本研究構建大鼠肌腱損傷模型,擬探討蠶絲-PLAG材料復合工程支架對肌腱損傷的修復作用。

在肌腱損傷修復中,設計生物膜或者管狀支架植入損傷部位,對于手術部位的固定有益,能夠提高抗拉強度,為術后早期活動創造穩定修復環境,有利于新肌腱的生成[14-15]。本研究中,實驗組術后行為不受影響,能夠正常跳躍,說明該支架的應用具有一定的可行性。肌腱有著與長軸平齊的具有層次感的纖維束結構,組織纖維排列整齊,呈正弦波型特征性結構[16-17]。本研究組織學評價顯示,實驗組術后3、4周肌腱膠原纖維排列整齊且致密,且膠原蛋白III表達較高,而對照組肌腱膠原纖維排列無規則,且比較松散,提示蠶絲-PLGA復合工程支架能夠促進肌腱損傷的修復,提高腱化效果。另外,本研究生物力學結果顯示,實驗組術后2、3、4周的肌腱最大拉力載荷均增大,充分證明蠶絲-PLGA復合工程支架能夠促進肌腱的愈合,增強其生物力學特性,是治療肌腱損傷的有效措施。

綜上,蠶絲-PLGA復合工程支架能夠促進肌腱損傷修復,提高膠原蛋白III的表達,增強生物力學特性,是肌腱損傷的有效治療手段。