Prdm14對C3H10T1/2細胞增殖及干性的影響*

龍春蘭,周 宇,易 勤,譚 彬,許 皓,魏光輝,朱 靜△

1.國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心,重慶400014; 2.揚州大學附屬淮安市婦幼保健院兒童康復科,江蘇淮安 223001;3.兒童發育疾病研究教育部重點實驗室,重慶400014;4.兒科學重慶市重點實驗室,重慶400014;5.重慶醫科大學附屬兒童醫院檢驗科,重慶400014;6.重慶醫科大學附屬兒童醫院泌尿外科,重慶 400014

Prdm14在早期多能性細胞、原始生殖細胞(PGCs)以及胚胎干細胞(ESCs)中表達,具有維持細胞干性和抑制細胞分化的效應[4-5]。ESCs中,多能性主要由轉錄因子Oct4、Sox2和Nanog等構成的核心轉錄調控網絡來維持[6]。全基因組定位分析顯示,Prdm14與Oct4、Nanog、Sox2等其他關鍵轉錄因子廣泛共定位,表明Prdm14已整合到核心轉錄調控網絡中[7-8]。在PGCs 發育過程中,重獲多向分化潛能是PGCs命運決定的重要調控事件之一,而Prdm14是PGCs 能否重新獲得多向分化潛能的關鍵調控因子。在PGCs 中,Prdm14與Tfap2c和Blimp1協同作用,上調生殖細胞和多能性基因,同時抑制WNT信號和體細胞標記物[9]。Prdm14的表達隨著 PGCs 分化而受到抑制,在一定條件下,來源于Prdm14+/+胚胎的PGCs 能夠去分化形成多能性的胚胎生殖細胞,而Prdm14-/-胚胎的原始生殖樣細胞(PGCLCs)幾乎不能形成胚胎生殖細胞樣克隆,并且Prdm14-/-的PGCLCs中,其核心多能性基因及生殖細胞相關基因未能重新激活[10]。

Prdm14也有助于在缺乏多向分化潛能的細胞中誘導多能性。研究顯示,當 Prdm14 與 Oct4、Sox2、Klf4 共同表達時能夠提高成纖維細胞的重編程效率[7]。與植入后的外胚層和ESCs相比,外胚層干細胞(EpiSC)不表達Prdm14,并且不具備向PGCs特化的潛能,外源性Prdm14能與Klf2協同作用,加速和促進小鼠EpiSCs向幼稚多能狀態的ESCs逆轉及向PGC特化[11-12]。

Prdm14可通過干性因子等構成的轉錄調控網絡來調節ESCs、生殖細胞的多能性,然而,Prdm14在其他細胞中的表達及作用如何,尚不清楚。因此,本研究擬探討Prdm14對C3H10T1/2細胞增殖及干性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C3H10T1/2細胞(中國科學院細胞庫)。

1.2儀器與試劑 CO2恒溫培養箱(美國 Thermo公司),熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司),凝膠成像儀(美國 Bio-Rad公司),倒置熒光顯微成像系統(日本 Nikon公司),柱式RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司],過表達Prdm14慢病毒(上海吉凱基因化學技術有限公司),胎牛血清、DMEM/F12培養基(美國Gibco公司),胰蛋白酶(美國Sigma公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司),兔抗Prdm14 抗體(Abcam公司,批號:187881),兔抗Sox2抗體(ProteinTec公司,批號:11064-1-AP),兔抗Oct4抗體(ProteinTec公司,批號:11263-1-AP),兔抗Nanog抗體(Zenbio公司,批號:385080),小鼠抗β-actin、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、Cy3山羊抗兔二抗、Cy3山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)、Hoechst 33342(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 取生長良好的對數期C3H10T1/2細胞,消化傳代后,補充新鮮完全培養基(含10%胎牛血清)至10 mL,晃動培養皿,使細胞均勻分布,于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養。

1.3.2構建Prdm14過表達細胞株 本研究選用Tet-on可誘導基因表達慢病毒系統,可在目的細胞中獲得可靈敏調控的目的基因表達。在細胞培養基中不含多西環素(Dox)時,目的基因本底表達量極低,加入Dox后,目的基因誘導表達量極高。載體信息如下: 基因名稱為Prdm14(NM_001081209),載體名稱為CV259,元件順序為 TetIIP-MCS-3FLAG-CMV-EGFP-Ubi-TetR-IRES-Puromyc。本實驗分為空白組(正常C3H10T1/2)、陰性對照組(感染慢病毒空載體的C3H10T1/2)以及實驗組(感染Prdm14慢病毒的C3H10T1/2)。

基于對青少年自我價值感及道德判斷能力與價值觀關系的研究，在自我價值感中，自我觀與人際情感之間具有正向關系，其他則為負向。換言之，自我觀越重的學生，其自我價值感越強，并以此更加關注自身的成長，形成良性循環。與此同時，群體觀與自我價值感卻存在著互相關聯，自我觀強導致群體觀低、人際價值感高。

按2×104個細胞/孔于無菌6孔板中均勻接種細胞,培養12 h后,加入適量病毒,感染24 h后更換為完全培養基,繼續培養48 h,倒置熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達情況,以確定慢病毒是否感染成功。嘌呤霉素篩選后,經Dox誘導48 h,收集細胞用作后續檢測。

1.3.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Prdm14 mRNA表達 參考RNA柱式提取試劑盒說明書,提取總RNA進行反轉錄,隨后將經反轉錄產物進行RT-qPCR,以β-actin為內參,以2-ΔΔCt計算基因相對表達量,檢測3組細胞中Prdm14 mRNA表達情況,引物見表1。

表1 引物序列

1.3.4蛋白質印跡法(WB)檢測 收集細胞沉淀,加入400 μL裂解液[含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)],直接混勻,冰上裂解10 min離心,取上清液,即為總蛋白;變性后的蛋白經聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜、封閉后,加入稀釋好的一抗(Prdm14、Sox2、Oct4、Nanog),4 ℃過夜。次日,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜經復溫、TBST緩沖液漂洗后,加入相應的二抗,室溫孵育1 h,隨后采用電化學發光(ECL)試劑,于化學發光顯影成像系統成像,采集圖片,通過Image J對圖像灰度值進行分析。

1.3.5堿性磷酸酶(ALP)檢測 ALP主要存在于物質交換活躍處。ESCs、PGCs 前體細胞等干性細胞均呈ALP陽性,為進一步探索高表達 Prdm14對 C3H10T1/2細胞的作用,本研究進行了ALP 活性檢測。分別收集陰性對照組和實驗組細胞,制成細胞懸液,取100 μL細胞懸液滴于防脫載玻片,室溫充分干燥后,4%多聚甲醛固定,滴加配制好的ALP孵育液,進行ALP染色,鏡檢,ALP活性部位為藍色;根據ALP活性檢測試劑盒說明書,檢測在不同組別培養上清液中的ALP活性,以DEA酶活力單位表示。

1.3.6細胞增殖能力檢測 96孔板中按3 000個細胞/孔加入細胞懸液,每組細胞設6個復孔,輕晃培養板,使細胞均勻分布,于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養;實驗設置5個Dox誘導時間點:0、24、48、72、96 h,每日觀察細胞生長狀況并及時更換新的誘導培養基,在不同時間點吸棄板中的舊培養基,每孔重新加入含10 μL CCK-8的完全培養基100 μL,于恒溫細胞培養箱中孵育2 h,用酶標儀測定450 nm 處吸光度(A)。

1.3.7細胞克隆形成實驗 取生長良好的對數期細胞,以每孔400、800、1 600個細胞的梯度密度分別接種于6 cm培養皿中,混勻,置37 ℃、5% CO2條件下,靜置培養14 d,培養7 d時換液。14 d后,終止培養。多聚甲醛固定后采用結晶紫染色,洗去染色液,空氣干燥。采用Image J測定克隆直徑,并計數大于10個細胞的克隆數。

2 結 果

2.1構建 C3H10T1/2-Prdm14 過表達細胞株 采用Tet-on系統構建 C3H10T1/2-Prdm14 過表達細胞株,經嘌呤霉素篩選后,Dox 誘導 48 h,可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,見圖 1A。進一步采用 qRT-PCR 和WB分別檢測 Prdm14 的 mRNA 和蛋白表達情況,結果顯示,與陰性對照組相比,實驗組中 Prdm14 的 mRNA 和蛋白水平均明顯升高(P<0.05),見表2和圖1B、C。

注:A表示慢病毒感染細胞經Dox誘導48 h后,綠色熒光蛋白表達情況; B表示不同組別細胞中Prdm14 mRNA表達情況;C表示不同組別細胞中Prdm14蛋白水平;實驗組與空白組相比,*P<0.05;實驗組與陰性對照組相比,#P<0.05。圖1 C3H10T1/2-Prdm14 過表達細胞株構建及鑒定

表2 各組Prdm14 的 mRNA 和蛋白水平比較

2.2細胞增殖能力檢測 采用CCK-8檢測了陰性對照組和實驗組細胞的增殖能力,結果顯示,實驗組細胞增殖能力較陰性對照組明顯增加(P<0.05),見圖2A。細胞克隆形成實驗顯示,實驗組克隆數與陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05),但實驗組平均克隆直徑增加,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2B和表3。

注:A表示細胞增殖能力情況;B表示細胞克隆形成能力情況;同一時間點實驗組與陰性對照組相比,*P<0.01。圖2 Prdm14高表達對細胞增殖能力的影響

表3 細胞克隆數和克隆直徑情況

2.3ALP檢測 ALP檢測結果顯示:C3H10T1/2 過表達 Prdm14 后,細胞膜、細胞質出現藍色顆粒(圖3A),其分泌的ALP活性[(20.76±0.52)個DEA酶活力單位]也較陰性對照組[(8.37±1.44)個DEA酶活力單位]明顯增加(P<0.05),見圖3B。

2.4干性因子表達檢測 C3H10T1/2細胞中過表達Prdm14后,采用WB檢測主要干性因子的表達情況。結果顯示,實驗組干性因子Sox2、Nanog蛋白水平均較陰性對照組升高(P<0.05),Oct4蛋白水平與陰性對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表4和圖4。

注:A為WB檢測不同組別細胞中干性因子Sox2、Nanog以及Oct4蛋白水平;B為對A圖進行灰度值量化結果;實驗組與陰性對照組相比,*P<0.05。圖4 C3H10T1/2高表達Prdm14后干性因子的表達情況

表4 Sox2、Nanog以及Oct4蛋白水平變化情況

3 討 論

間充質干細胞(MSCs)來源于胚胎發育早期的中胚層未成熟的胚胎結締組織,是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體干細胞,在特定情況下可誘導分化為多種組織細胞。作為優選的組織工程種子細胞,在細胞替代治療、基因治療以及組織器官再造中具有重要的臨床應用價值。C3H10T1/2細胞是由REZNIKOFF等[13]于1972年從C3H系小鼠胚胎分離建立的MSCs株,其形態為成纖維細胞樣,也稱為小鼠胚胎成纖維細胞,它具有多能分化的功能,可向脂肪、骨、肌等分化[14-16]。在體外培養早期,未分化的MSCs可表達轉錄因子Oct4、Nanog和Sox2,但隨著培養時間的延長,其增殖能力、分化潛能減弱,甚至檢測不到Oct4表達[17]。與之類似,本研究發現,在C3H10T1/2細胞中,主要干性因子Sox2、Nanog、Oct4表達均不高;并且ESCs、PGCs 前體細胞等干性細胞表達的ALP在C3H10T1/2細胞也表現為陰性,這可能與MSCs經過長時間的體外培養自身的干性減弱,發生自發性分化有關。離體培養的MSCs干細胞注入體內后,其干性降低,往往不能按照預期的方向進一步分化,進而限制了其應用。因此,干細胞干性的維持對其臨床應用具有重要意義。

Prdm14為PRDM家族的重要成員,通過表觀遺傳學重編程、轉錄激活、抑制等過程,調節ESCs多能性、生殖細胞特化和發育[5,10,18-19],然而,Prdm14在MSCs中的表達及作用少見報道。本研究發現,C3H10T1/2細胞中內源性Prdm14水平較低,當過表達Prdm14后,C3H10T1/2細胞增殖能力增強,ALP活性增加,表明Prdm14在一定程度上能提升C3H10T1/2細胞自我更新能力。OKASHITA等[12]報道,在外胚層樣細胞(EpiLCs)中,誘導Prdm14表達可上調干性相關基因。與之類似,本研究也發現Prdm14在C3H10T1/2細胞過表達能上調干性因子Sox2、Nanog的表達,進一步證實Prdm14對C3H10T1/2細胞的干性具有一定的促進作用。有研究顯示,Prdm14在多種腫瘤中表達,能賦予癌細胞干性特性,促進細胞生存及腫瘤發生[20]。但在本研究中,Oct4的表達并未明顯增加,細胞克隆數亦無明顯變化,表明Prdm14對于C3H10T1/2細胞干性的誘導是有限的,并不會導致其向腫瘤方向發展。

值得注意的是,Prdm14既能與Oct4、Sox2等基因位點結合,自身的位點又是Nanog、Sox2等的靶點[3]。因此,盡管Prdm14能促進C3H10T1/2細胞干性因子表達,但其功能可能存在差異。在ESCs中,Prdm14與核心干性因子共同調控多能性相關基因網絡,抑制促分化基因,維持ESCs可塑狀態[18]。但在EpiLCs建立過程中,幼稚狀態的ESCs多能性網絡解體,EpiLCs的Nanog結合模式在全基因組范圍內發生了變化:ESCs中,Nanog結合多能性因子,促進多能性狀態,而EpiLCs中,Nanog結合并激活PGCs特化的關鍵因子Prdm1和Prdm14的增強子,進而誘導EpiLCs分化為PGCLCs[21]。

Prdm14在不同細胞中發揮的作用不盡相同。C3H10T1/2細胞中,Prdm14過表達能促進其增殖以及干性相關因子表達增加,但是否能進一步向生殖系方向分化及其調控機制均值得進一步深入研究。