膽紅素代謝通路主要酶的基因多態(tài)性研究進(jìn)展*

段改原,李宇晨,蔣 雪 綜述,劉 玲 審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院,云南昆明 650500;2.大理大學(xué)研究生院,云南大理 671000;3.云南省昆明市兒童醫(yī)院新生兒科,云南昆明 650103

膽紅素來源于體內(nèi)的血紅素,是血紅蛋白及其他血紅素蛋白在單核-巨噬細(xì)胞或其他網(wǎng)織內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中的代謝終產(chǎn)物。血紅素在微粒體血紅素氧合酶1(HO-1)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細(xì)胞色素c還原酶的作用下形成膽綠素,再由膽綠素還原酶(BLVR)還原為膽紅素,此時的膽紅素為未結(jié)合膽紅素(UCB)。UCB在血液中與清蛋白結(jié)合形成復(fù)合體,經(jīng)血液循環(huán)運輸至肝臟的Disse腔后與清蛋白分離,分離后的UCB在有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運肽2(OATP2)的作用下進(jìn)入肝細(xì)胞,并與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Y蛋白和Z蛋白結(jié)合,被運輸至肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),膽紅素在此被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDPGT)催化與葡萄糖醛酸進(jìn)行1～2次結(jié)合反應(yīng),形成結(jié)合膽紅素(CB),CB又經(jīng)多藥耐受相關(guān)蛋白2(MRP2)從肝細(xì)胞排出,并經(jīng)膽道系統(tǒng)排入腸腔,其中,部分CB在腸道細(xì)菌的作用下分解為未結(jié)合膽紅素,經(jīng)腸肝循環(huán)再次入血。

總之,膽紅素代謝是人體內(nèi)一個復(fù)雜且受多因素影響的過程,代謝過程中任意一個環(huán)節(jié)異常均可引起血清膽紅素升高,造成嚴(yán)重不良后果。據(jù)報道,高膽紅素血癥是新生兒常見的疾病之一。該病主要表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染,嚴(yán)重者可出現(xiàn)膽紅素腦病和肝功能損傷等并發(fā)癥,留下明顯的后遺癥。近年來,國內(nèi)外學(xué)者對膽紅素代謝酶基因多態(tài)性開展了廣泛的研究,尤其是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1B1(SLCO1B1),這些編碼基因突變將導(dǎo)致相應(yīng)的酶或轉(zhuǎn)運蛋白功能障礙,嚴(yán)重影響膽紅素代謝。本文就國內(nèi)外關(guān)于G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多態(tài)性研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 G-6-PD

G-6-PD是人體內(nèi)的管家酶,參與催化磷酸戊糖旁路途徑產(chǎn)生NADPH,而NADPH是預(yù)防氧自由基引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的重要物質(zhì)。因此,當(dāng)G-6-PD缺乏或活性降低時會影響NADPH的生成,紅細(xì)胞極易受氧化性損傷失去變形能力,在血流沖擊和毛細(xì)血管的擠壓作用下被破壞,發(fā)生急性溶血進(jìn)而引起高膽紅素血癥。G-6-PD基因定位于X染色體長臂2區(qū)8帶(Xq28),由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成,全長約18 kb,編碼的G-6-PD由515個氨基酸組成。G-6-PD缺乏的遺傳方式為X染色體不完全顯性遺傳。男性患者只有一條X染色體,為半合子,酶活性常顯著缺乏。女性兩條X染色體上一般只有一條有G-6-PD基因缺陷,為雜合子,其酶活性可正常至顯著缺乏。根據(jù)遺傳規(guī)律,該病男性患者常多于女性患者。BAHR等[1]曾報道了一個來自歐洲血統(tǒng)的北美家庭家族性G-6-PD缺乏,包括64名家族成員、涉及7代人,其中就有35名男性患有嚴(yán)重G-6-PD 缺乏癥(c.637G>T)。

G-6-PD缺乏是人類最常見的酶缺乏疾病之一,在世界范圍內(nèi)廣泛存在,全球約5億人受累,但患病率差異很大,在部分非洲地區(qū)的患病率>20%,在亞洲地區(qū)如中國、印度等的患病率為10%～15%,在緬甸的患病率則>20%,在美洲地區(qū)如美國、巴西等的患病率為5%～10%[2]。迄今為止,約200種G-6-PD基因突變被報道,G-6-PD基因多態(tài)性存在地域、種族差異。據(jù)國外研究報道,非洲人G-6-PD基因突變以p.Asn126Asp(G-6-PD A+)、p.Val68Met (G-6-PD Asahi)和p.Ile48Thr(G-6-PD Aures)常見,歐洲人則以p.Ala335Thr(G-6-PD Chatham)為主[3]。阿拉伯地區(qū)以p.Tyr437Tyr常見,而且p.Asp135Thr、p.Ser179Asn、p.Arg246Leu、p.Glu307Pro突變僅在阿拉伯人群中被報道[4]。BOONYAWAT等[5]報道在泰國G-6-PD缺乏的兒童中,最常見的突變?yōu)閏.871G>A,其次為c.1376G>T、c.1388G>A、c.487G>A。G-6-PD基因不同位點突變導(dǎo)致G-6-PD不同程度失活,出現(xiàn)高膽紅素血癥,甚至出現(xiàn)核黃疸。2015年,LIU等[6]納入了研究對象來自以色列、美國、印度及中國臺灣地區(qū)的5篇原始文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析,發(fā)現(xiàn)G-6-PD缺乏的新生兒高膽紅素血癥和光療風(fēng)險分別是G-6-PD正常新生兒的3.92倍和3.01倍,但未進(jìn)行突變亞群分析。然而,WISNUMUTI等[7]報道印度尼西亞Deutromalay人群新生兒最常見的G-6-PD基因突變是c.871G>A,其次是c.1376G>T和p.Leu128Pro,但是病例組(1.72%)與對照組(1.74%)G-6-PD缺乏癥的患病率相似,G-6-PD基因多態(tài)性與印度尼西亞Deutromalay人群新生兒高膽紅素血癥無明顯關(guān)系。造成以上不同結(jié)論的原因多考慮是納入的研究對象存在明顯種族差異。此外,G-6-PD缺乏的嬰兒更容易發(fā)生核黃疸。CUNINGHAM等[8]報道美國發(fā)生核黃疸的嬰兒中有20%為G-6-PD缺乏,并且發(fā)生核黃疸后,G-6-PD缺乏的嬰兒病死率約15%,而G-6-PD正常嬰兒僅為1%。

我國G-6-PD缺乏的總體患病率約2.1%,基因突變以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G最常見,不同地區(qū)患病率差異較大,北方地區(qū)低于南方地區(qū)[9]。LIU等[10]對中國2013-2017年共6 919 647例新生兒進(jìn)行G-6-PD缺乏篩查,發(fā)現(xiàn)最常見的3個突變與HE等[9]報道的一致,并首次報道了4個變異位點:c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C和c.1285A>G。G-6-PD缺乏癥主要發(fā)生在華南地區(qū),其基因多態(tài)性因地區(qū)和種族而存在差異,如:c.487G> A在山東和山西很普遍,但在廣東、廣西和浙江卻很少;c.592C>T及c.1360C>T僅在廣東、廣西、山東和浙江等沿海地區(qū)的新生兒中發(fā)現(xiàn)。TONG等[11]對中國東南部地區(qū)1 565例高膽紅素血癥嬰兒進(jìn)行G-6-PD基因檢測,發(fā)現(xiàn)439例(28.1%)存在G-6-PD突變。除最常見的3種突變外,該研究還檢測到一個新的錯義突變——c.1118 T>C,位于G-6-PD基因外顯子9,這種錯義突變使G-6-PD活性明顯降低,出現(xiàn)嚴(yán)重高膽紅素血癥。

總而言之,G-6-PD缺乏在世界各國普遍常見,部分G-6-PD基因突變可引起嚴(yán)重高膽紅素血癥,造成核黃疸,甚至死亡。因此,對新生兒進(jìn)行G-6-PD缺乏篩查非常必要,如若條件允許,建議將G-6-PD缺乏篩查納入常規(guī)產(chǎn)前檢查,對于父母存在G-6-PD缺乏或突變攜帶的患兒能夠盡早診斷,及時治療。

2 UGT1A1

UGT1A1現(xiàn)已被證實是人體內(nèi)唯一能降低血清膽紅素的酶,其編碼基因位于2號染色體長臂37區(qū)8帶(2q37),是由第1外顯子和4個共同外顯子(第2～5)組成的復(fù)合體,基因全長218 kb,mRNA長2.36 kb。UGT1A1基因多態(tài)性主要發(fā)生在編碼區(qū)外顯子、啟動子,也可發(fā)生在遠(yuǎn)端加強(qiáng)序列、內(nèi)含子及剪接位點。UGT1A1基因不同位點突變將導(dǎo)致UGT1A1活性不同程度降低,表現(xiàn)為Gilbert綜合征(GS)、Crigler-Najjar綜合征Ⅰ型及Ⅱ型(CNS-Ⅰ/Ⅱ)。膽紅素不僅具有神經(jīng)毒性,還可加重UGT1A1基因缺陷者肝功能損害。LIU等[12]曾報道在UGT1A1基因敲除的小鼠體內(nèi)UCB增加可以刺激kuffer細(xì)胞釋放炎癥因子,進(jìn)而激活肝臟星狀細(xì)胞,在膽紅素的刺激下,肝臟中的核因子(NF)-κB抑制劑α(IκB-α)、NF-κB抑制物激酶-β(IKK-β)和p65被過度磷酸化,導(dǎo)致NF-κB活化進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA損傷。此外,NF-κB的激活還可抑制UGT1A1的表達(dá),從而加重高膽紅素血癥,如此形成了一個惡性循環(huán)。因此,臨床醫(yī)生在診治高膽紅素血癥合并肝功能損害的患者時,若其存在UGT1A1基因缺陷,應(yīng)格外重視。

目前UGT1A1基因突變已發(fā)現(xiàn)約163種,多為啟動子及編碼區(qū)外顯子突變。啟動子多態(tài)性以TATA盒插入突變最常見,其序列的長度與高膽紅素血癥程度呈負(fù)相關(guān)。UGT1A1基因可以精確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列,而啟動子TATA盒突變會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始的頻率和準(zhǔn)確性異常,即使可以產(chǎn)生有正常結(jié)構(gòu)的酶分子,但其表達(dá)減少會降低酶的活性,進(jìn)而影響膽紅素代謝。TATA盒突變是GS的遺傳基礎(chǔ),純合A(TA)6TAA為野生型,其余為突變型,以A(TA)7TAA突變最常見。研究發(fā)現(xiàn),A(TA)7TAA在非洲裔美國人中突變率較高,約為44.6%,在高加索人群中突變率約38.8%,在俄羅斯人中突變率約為38.5%,在越南人中突變率約為6.0%,而在中國人中突變率相對較低,約為1.0%[13-15]。有研究表明復(fù)合雜合A(TA)7TAA和c.211G>A,或單一純合A(TA)7TAA是我國漢族人群GS的主要基因型,并且顯著增加患高膽紅素血癥的風(fēng)險[16]。但在巴拿馬地區(qū),A(TA)7TAA多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥之間無明顯關(guān)系[17],這可能與環(huán)境因素如日照、飲食有關(guān)。LI等[18]的一項薈萃分析認(rèn)為A(TA)7TAA多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥無關(guān),但納入的原始研究較少(僅4篇),未來仍需要更多高質(zhì)量、大樣本量的研究來證實。TATA盒突變除A(TA)7TAA外,也有A(TA)8TAA、A(TA)5TAA的報道。DAPR等[19]應(yīng)用Taqman PCR技術(shù)對53例GS患者UGT1A1(TA)n多態(tài)性進(jìn)行基因分型,發(fā)現(xiàn)39.6%是野生型,24.5%為A(TA)7TAA純合突變,30.2%為A(TA)7TAA雜合突變,A(TA)7TAA和A(TA)8TAA復(fù)合雜合突變、A(TA)5TAA雜合突變各占1.9%。UGT1A1基因編碼區(qū)以第1外顯子c.211G>A錯義突變最常見,尤其是c.211G>A純合突變使UGT1A1活性明顯降低,表現(xiàn)為GS或CNS-Ⅱ。CHEN等[20]使用慢病毒載體和COS-7細(xì)胞建立體外UGT1A1野生型和c.211G>A純合及雜合突變的細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)c.211G>A純合子及雜合子UGT1A1活性分別為野生型的22.0%和71.0%,純合酶活性明顯低于雜合酶,原因可能是c.211G>A突變影響了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象,降低了酶與底物的結(jié)合。c.211G>A突變是新生兒高膽紅素血癥的危險因素,主要見于中國、日本、韓國等亞洲黃種人,在歐洲、美洲等白種人較少見[15,21]。除c.211G>A外,外顯子c.3279 T>G也有報道。2020年,LI等[22]納入了7項病例對照研究進(jìn)行薈萃分析,發(fā)現(xiàn)c.3279 T>G是新生兒高膽紅素血癥的易感因素,但是其納入的研究對象包括亞洲人群、非洲人及高加索人,其人種、環(huán)境、生活習(xí)慣的異質(zhì)性可能影響薈萃分析的結(jié)果。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因檢測技術(shù)的進(jìn)步,越來越多的突變位點被報道。2022年,GU等[13]報道在中國人群中新發(fā)現(xiàn)了7個變異位點,分別是p.Ala61Gly、p.Leu166Alafs*16、p.Ser306Phe、p.Glu424*、p.R341Q、p.R240K、p.Y67F,其中前4個變異可能是致病變異,后3個變異意義不明。這可能是因為UGT1A1基因與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),除高膽紅素血癥外,UGT1A1基因多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、直腸癌等癌癥以及伊立替康導(dǎo)致化療相關(guān)性腹瀉、中性粒細(xì)胞減少均有關(guān)系。對于意義不明的突變是否與臨床表型相關(guān),未來可以利用基因重組技術(shù)進(jìn)行基因敲除,從而進(jìn)行功能驗證。

3 SLCO1B1

SLCO1B1基因編碼的OATP2在肝細(xì)胞攝取膽紅素的過程中起重要作用,SLCO1B1基因突變將影響OATP2轉(zhuǎn)運功能,進(jìn)而引起高膽紅素血癥。SLCO1B1基因位于12號染色體短臂1區(qū)2帶(12p12),全長108.59 kb,由15個外顯子和14 個內(nèi)含子組成。人類OATP2的cDNA包含2 073個堿基對,編碼691個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn),與在人腦、腎臟、肝臟和睪丸中均高度表達(dá)的人OATP1相比,OATP2的強(qiáng)信號僅在肝臟中檢測到,是肝細(xì)胞基底膜外側(cè)將有機(jī)陰離子、未結(jié)合膽紅素等轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)的一種極其重要的轉(zhuǎn)運蛋白。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的SLCO1B1基因突變已超過100余種,研究最多的是c.388 G>A及c.521 T>C。PASANEN等[23]研究了來自非洲、中東、亞洲、歐洲、大洋洲和美洲的52個人群SLCO1B1等位基因分布,發(fā)現(xiàn)c.521T>C頻率在人群之間顯著不同,在美國人群中為24.0%,在歐洲人群中18.0%,在撒哈拉以南非洲人群中為1.9%,在大洋洲人群中為0.0%,并且經(jīng)種群之間相比發(fā)現(xiàn),SLCO1B1基因在種群內(nèi)部更具多樣性。LEE等[24]研究發(fā)現(xiàn)c.521T>C在歐美人群中突變頻率較高,約14%,在非裔美國人中則為2%,與PASANEN等[23]結(jié)果一致;相反,c.388A>G則主要見于非裔美國人,約74%,歐美人則為30%。BOO等[25]研究認(rèn)為SLCO1B1變異體在馬來西亞新生兒中普遍存在(49.3%),其中,c.388 G>A占26.3%,c.512 T>C占23.0%,而且c.388 G>A是新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險因素。AMANDITO等[26]報道c.512 T>C在印度尼西亞高膽紅素血癥新生兒中很常見,但其多態(tài)性與膽紅素水平無關(guān)。在國內(nèi),BAI等[27]、LI等[28]均認(rèn)為c.521T>C是中國人群高膽紅素血癥的遺傳危險因素,但張鈺恒等[29]的研究不支持此觀點。我國幅員遼闊、民族眾多,地域、民族異質(zhì)性可能是造成以上不同觀點的主要原因;其次是研究樣本數(shù)量有限,代表性欠佳,未來仍需擴(kuò)大樣本研究,進(jìn)一步對民族亞群進(jìn)行分析。

4 HO-1

血紅素氧合酶(HO)的編碼基因位于染色體22q12上,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,是細(xì)胞內(nèi)唯一能分解血紅素的管家酶,相對分子質(zhì)量約為33×103,是一種單體蛋白,可將血紅素降解為等摩爾量的一氧化碳、游離鐵和膽綠素。HO以3種活性異構(gòu)體(HO-1、HO-2和HO-3)存在。HO-1,也稱為熱休克蛋白 32(Hsp32),是一種誘導(dǎo)型亞型,其表達(dá)可被不同的應(yīng)激條件上調(diào),并被多種刺激激活;HO-2和HO-3為組成型亞型,在大多數(shù)人體組織中以基礎(chǔ)水平表達(dá),但在神經(jīng)元、脾臟和肝臟中的水平較高。HO-1活性在很大程度上取決于轉(zhuǎn)錄水平。然而,HO-1啟動子的表達(dá)受腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、神經(jīng)生長因子、白細(xì)胞介素、γ-干擾素及其底物等多種刺激因子調(diào)節(jié)。因此,這些刺激因子水平可間接影響HO-1活性,最終引起一系列疾病。

目前關(guān)于HO-1基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究主要集中在啟動子區(qū)域(GT)n重復(fù)多態(tài)性,而且短(GT)n等位基因可能是高膽紅素血癥的遺傳危險因素[30]。TIWARI等[31]報道印度新生兒(GT)n重復(fù)長度在15～40個,短(GT)n重復(fù)(≤20個)是新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素。KATAYAMA等[32]報道日本新生兒(GT)n重復(fù)長度在16～41個,排除UGT1A1基因211G>A多態(tài)性攜帶者后,短(GT)n等位基因(<22個)的攜帶者新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生率更高。以上兩項研究表明不同地區(qū)(GT)n的重復(fù)長度范圍差異不大,短(GT)n增加了患高膽紅素血癥的風(fēng)險。但是,在一項針對非裔美國嬰兒的(GT)n多態(tài)性研究中,將等位基因長度分為短(S,<25個)、中 (M,25～33個)、長(L,>33個),其中有12.2% 的等位基因是S,但是至少有1個L等位基因的嬰兒與至少有1個S等位基因的嬰兒之間的總膽紅素血癥風(fēng)險百分位數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(48.6±34.0)%vs.(44.9±31.6)%,P=0.51][33]。這些研究結(jié)果不一致可能與地域、種族差異有關(guān),前兩項研究以亞洲人群為研究對象,后一項研究則以非裔人群為研究對象。但也有可能是因為膽紅素水平易受到其他遺傳因素或環(huán)境因素的影響。總體而言,目前關(guān)于HO-1基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關(guān)性研究較少,結(jié)論不一,對于(GT)n重復(fù)長短定義也不同,未來仍需大量樣本進(jìn)行研究,以定義出短(GT)n數(shù),并對多項研究薈萃分析短(GT)n是否為高膽紅素血癥的危險因素。

5 BLVRA

BLVR有2種同工酶,即BLVRA和BLVRB。BLVRA水平在妊娠20周時增加,而BLVRB在妊娠14～15周可以被檢出。BLVRA的mRNA在腦、肺和胰腺中水平較高,在肝臟和胎盤中水平較低。BLVRA將膽綠素Ⅸα還原為膽紅素Ⅸα,即未結(jié)合膽紅素,是成人膽紅素的主要形式。BLVRB存在于成人的所有組織中,其功能作用尚未完全闡明。HO在β-meso位置裂解胎兒血紅素,產(chǎn)生膽綠素Ⅸβ,再由BLVRB還原為膽紅素Ⅸβ,膽紅素Ⅸβ的溶解度較高,可以直接排泄。因此,BLVR基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究主要為BLVRA多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究。編碼人膽綠素-Ⅸα還原酶的cDNA核苷酸長度約1 146 bp,編碼296個氨基酸。BLVRA主要以單體形式存在,是血紅蛋白氧化酶-膽紅素抗氧化系統(tǒng)的重要成員之一,具有蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸蛋白激酶的活性,可以激活TF-2和HO-1的轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。BLVRA基因突變導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變,影響其功能。LI等[28]報道rs699512基因座是BLVRA基因唯一常見的非同義單核苷酸多態(tài)性,其錯義突變使極性蘇氨酸(Thr)變?yōu)榉菢O性丙氨酸(Ala),使BLVRA活性增加,最終引起膽紅素升高,是中國漢族新生兒人群中新生兒高膽紅素血癥的易感基因。周進(jìn)福等[34]以福建地區(qū)新生兒高膽紅素血癥患兒為研究對象,發(fā)現(xiàn)rs699512位點A等位基因及rs1637530位點C等位基因是新生兒高膽紅素血癥的易感基因,但YANG等[35]研究認(rèn)為rs699512位點多態(tài)性和新生兒高膽紅素血癥無明顯相關(guān)。目前為止,BLVRA基因多態(tài)性與高膽紅素血癥相關(guān)性研究較少,其具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明,未來有待進(jìn)一步研究。

6 小結(jié)與展望

綜上所述,G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多態(tài)性均存在地域、種族差異,不同突變位點在不同人群中基因頻率不同,而且G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1基因突變具有積累效應(yīng),攜帶風(fēng)險因素的數(shù)量越多,發(fā)生高膽紅素血癥及其并發(fā)癥的風(fēng)險就越大。但截至目前,大多數(shù)研究局限于基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關(guān)性,對其治療及預(yù)后研究甚少,而且由于研究樣本數(shù)量有限,部分研究結(jié)果相悖。隨著科技的發(fā)展及基因檢測技術(shù)的進(jìn)步,人類將迎來基因時代,未來仍需進(jìn)行大樣本基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關(guān)研究,對于存在基因突變的高膽紅素血癥患者,以期治療上能從基因方面取得突破。