肝細胞癌患者血清長鏈非編碼RNA LINC00673水平及其臨床意義*

任虎虎,李 晨,陳 建,吳智群

空軍軍醫大學唐都醫院介入科,陜西西安 710032

原發性肝癌是一種起源于肝臟組織的惡性腫瘤,75%～85%為肝細胞癌(HCC)[1]。據2014年數據統計,肝癌分別位居我國惡性腫瘤發病譜、死亡譜的第4位、第2位[2]。肝癌早期癥狀不典型,不易被發現,確診時常伴隨腫瘤轉移及相關并發癥,預后總體較差[3]。因此,對肝癌的研究受到臨床高度重視,尋找肝癌相關分子標志物,對于肝癌的病因診斷、治療指導、預后評估有重要意義。肝癌形成機制復雜,除了與病毒性肝炎、飲酒、黃曲霉毒素等因素相關外,還涉及分子學機制[4]。長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)是一類定位于細胞核或細胞質中且長度大于200個核苷酸的RNA分子,可參與基因表觀遺傳學表達調控,并在惡性腫瘤形成及進展過程中發揮重要作用[5]。lncRNA LINC00673為新近發現的lncRNA分子,定位于17q24.3上,在惡性腫瘤中呈異常表達[6]。但lncRNA LINC00673在肝癌中的確切表達情況少見報道,該分子能否作為血清標志物應用于HCC的臨床診治尚不明確。基于上述背景,本研究擬觀察HCC患者血清lncRNA LINC00673水平變化情況及其與臨床病理特征及預后的關系,以明確其臨床意義,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年1月空軍軍醫大學唐都醫院收治并確診的103例HCC患者為HCC組。HCC組中男86例,女17例;<60歲72例,≥60歲31例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期73例,Ⅲ～Ⅳ期30例;淋巴結轉移26例;血管侵犯54例;肝硬化83例;微癌栓15例;腫瘤分化程度:中高分化80例,低分化23例;腫瘤最大徑<3 cm 25例,≥3 cm 78例;血清甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 62例,≥400 μg/L 41例。納入標準:(1)符合《肝細胞癌臨床指南更新》中的相關診斷標準,經病理檢查確診[7];(2)術前未進行射頻消融、肝動脈栓塞化療、免疫治療等醫學干預;(3)無凝血功能障礙;(4)無精神系統疾病。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)臨床資料不完整;(3)不配合研究要求;(4)認知功能不正常或無法正常溝通;(5)生命終末期;(6)妊娠期或哺乳期女性。另選擇同期體檢健康志愿者103例為對照組,其中男84例、女19例,<60歲69例、≥60歲34例。HCC組和對照組性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經空軍軍醫大學唐都醫院醫學倫理委員會批準。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清lncRNA LINC00673水平檢測 收集受試者外周靜脈血5 mL,室溫環境下靜置60 min,在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min,收集上層血清并轉至收集管后,再在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,離心操作結束后于-80 ℃冰箱內凍存。采用TRIzolTMLS試劑盒(上海聯碩生物科技有限公司)提取受試者血清中的總RNA,采用反轉錄試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)合成cDNA,cDNA模板按5倍稀釋后置于-20 ℃冰箱內凍存。采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行基因擴增,反應條件:95 ℃下30 s預變性,95 ℃下10 s變性,60 ℃下30 s退火延伸,循環40次。lncRNA LINC00673上、下游引物分別為5′-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3′與5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′;內參GAPDH上、下游引物分別為5′-CTATGCAGCTCTTCTATGTGG-3′與5′-ATCCAACTGTGAATCAGCC-3′。lncRNA LINC 00673水平以2-ΔΔCt計算。

1.2.2隨訪情況 對103例患者進行5年門診復查隨訪,2022年1月截止,統計患者總生存情況。第1年每3個月隨訪1次,從第2年開始每6個月隨訪1次,檢查項目包括超聲、電子計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等。

2 結 果

2.1HCC組和對照組血清lncRNA LINC00673水平分析 RT-PCR結果顯示,lncRNA LINC00673在HCC組血清中的水平(4.37±1.06)明顯高于對照組(1.29±0.31),差異有統計學意義(t=28.303,P<0.001)。

2.2血清lncRNA LINC00673診斷HCC的ROC曲線分析 血清lncRNA LINC00673診斷HCC的曲線下面積(AUC)為0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截斷值為2.87時,靈敏度為75.70%,特異度為81.61%,準確度為78.70%。見圖1。

圖1 血清lncRNA LINC00673診斷HCC的ROC曲線

2.3不同臨床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表達情況比較 以ROC曲線最佳截斷值2.87為分界點,將103例HCC患者分為lncRNA LINC00673低表達組(血清lncRNA LINC00673水平<2.87,41例)與lncRNA LINC00673高表達組(血清lncRNA LINC00673水平≥2.87,62例)。lncRNA LINC00673高表達患者血清AFP水平≥400 μg/L、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴結轉移情況的比例明顯高于lncRNA LINC00673低表達患者(P<0.05),而lncRNA LINC00673高表達患者和lncRNA LINC00673低表達患者在性別、年齡、肝硬化、腫瘤分化程度、微癌栓情況方面比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表達情況比較[n(%)]

2.4不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線分析 103例HCC患者在隨訪5年間,失訪6例,獲得隨訪97例,其中生存53例,死亡44例,總生存率為54.64%。血清lncRNA LINC00673高表達組與lncRNA LINC00673低表達組5年總生存率分別為44.83%(26/58)、69.23%(27/39)。Kaplan-Meier生存曲線顯示,血清lncRNA LINC00673高表達患者5年生存率顯著低于lncRNA LINC00673低表達患者(Log-Rankχ2=6.007,P=0.014)。見圖2。

圖2 不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

隨著醫療技術的不斷發展,手術切除、射頻消融、肝動脈化療栓塞、放射性療法、分子靶向藥物等手段應用于肝癌治療,患者預后情況得到較大改善,但高復發與高轉移仍制約著患者的長期生存。有報道稱,肝癌患者根治性切除術后5年累積復發率可達70%,且復發腫瘤的侵襲性相較于原發腫瘤更高[8]。肝癌發病率較高,預后較差,對人類健康造成嚴重威脅。故尋找在肝癌早期診斷、病情評估、預后判斷中具有潛在應用價值的分子標志物十分必要。

lncRNA是一種無蛋白質編碼功能的RNA分子,能夠參與基因組印記、X染色體沉默、轉錄激活、染色質修飾、核內運輸等多個生命過程,還可參與調節細胞增殖和凋亡[9]。多項研究提示,在肝癌發病過程中,lncRNA起促進作用[10-11]。lncRNA LINC00673為lncRNA家族中的一種,在不同癌組織中存在高或低表達,在惡性腫瘤診斷或預后評估方面具有潛在優勢[12]。本研究顯示,lncRNA LINC00673在HCC組血清中的水平明顯高于對照組,提示lncRNA LINC00673在HCC中呈高表達,該分子可能參與了HCC發生。以往研究也提示惡性腫瘤的形成可能與lncRNA LINC00673有關,如李濤等[13]和高勇等[14]檢測結腸癌和胃癌患者癌組織中lncRNA LINC00673的水平,并與其對應的癌旁正常組織作對照研究,發現癌灶組織內lncRNA LINC00673水平明顯更高。本研究顯示血清lncRNA LINC00673診斷HCC的AUC為0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截斷值為2.87時,靈敏度為75.70%,特異度為81.61%,準確度為78.70%,提示血清lncRNA LINC00673對于HCC有一定的診斷價值,有望作為HCC的輔助診斷指標。此外,本研究發現lncRNA LINC00673高表達患者血清AFP水平≥400 μg/L、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴結轉移情況的比例明顯高于lncRNA LINC00673低表達患者(P<0.05),提示血清lncRNA LINC00673與HCC臨床病理特征關聯密切,該分子可能參與了HCC遷移、侵襲等癌細胞進展。郭紅艷等[15]報道,lncRNA LINC00673高表達能促進磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑關鍵分子表達,上調腫瘤相關因子zeste基因增強子同源物2(EZH2)和β-catenin水平,繼而促進胃癌MGC-803細胞增殖和克隆。ZHANG等[16]研究提示,lncRNA LINC00673沉默對抑制肝癌細胞上皮-間充質轉化及增殖、侵襲有積極作用。本研究103例HCC患者隨訪5年間,失訪6例,Kaplan-Meier生存曲線顯示血清lncRNA LINC00673高表達患者5年生存率顯著低于lncRNA LINC00673低表達患者,提示血清lncRNA LINC00673高表達與HCC不良預后有關。ZHANG等[17]和張依等[18]的研究與此相符。ZHANG等[17]發現lncRNA LINC00673高表達與胰腺癌患者存活率下降有關,可作為該腫瘤預后的標志物。張依等[18]提到,lncRNA LINC00673水平上升與肺癌預后不良相關。進一步分析可能原因為lncRNA LINC00673通過與組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)和果蠅EZH2相互作用,進而促進HCC的發生和發展,導致其預后不良[19]。

綜上所述,HCC患者血清lncRNA LINC00673水平升高,其水平與患者腫瘤最大徑、TNM分期、血管侵犯、淋巴結轉移、血清AFP水平有關,可導致預后不良,有望成為HCC診療相關的血清標志物。但其具體機制不明,有待細胞學實驗或動物模型實驗進一步驗證。