AST-YS08藥敏卡片檢測酵母菌體外抗真菌藥物敏感性的評價*

王蘇珍,張羽儀,周春妹,黃聲雷,王蓓麗,潘柏申,郭 瑋

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科,上海 200032

真菌感染是全球范圍內(nèi)感染性疾病相關(guān)死亡的主要因素[1]。侵襲性真菌感染對公共健康構(gòu)成了重大威脅[2]。嚴重的真菌感染常繼發(fā)于哮喘、艾滋病、癌癥、器官移植、使用皮質(zhì)類固醇等[3]。世界衛(wèi)生組織于2022年針對侵襲性真菌病頒布了第一份真菌重點病原體清單,其中新型隱球菌、白色念珠菌屬于嚴重優(yōu)先級[4]。

白色念珠菌是醫(yī)院獲得性侵襲性念珠菌病的主要病原體,近年來我國由非白色念珠菌引起的念珠菌血癥也有所增加[5]。非白色念珠菌更易產(chǎn)生耐藥性,并導(dǎo)致暴發(fā)性感染[6],而唑類藥物的耐藥率上升使得棘白菌素類藥物的使用增加[7]。我國隱球菌病發(fā)病率也呈上升趨勢[5]。常用的治療新型隱球菌感染的藥物包括兩性霉素B、5-氟胞嘧啶及氟康唑[8]。針對性預(yù)防與經(jīng)驗性治療是對侵襲性真菌感染高風(fēng)險人群的重要干預(yù)措施[9]。臨床微生物實驗室提供全面、準(zhǔn)確、快速的體外抗真菌藥敏試驗結(jié)果,可指導(dǎo)臨床治療、流行病學(xué)研究及監(jiān)測抗真菌藥物耐藥率。

目前常見的酵母菌藥敏試驗方法或試劑有微量肉湯稀釋法(BMD法)、紙片擴散法、濃度梯度(Etest)法,以及半自動藥敏板條、全自動藥敏系統(tǒng)。紙片擴散法成本較低,但有臨床折點的藥物少[10]。Etest法可提供最低抑菌濃度(MIC),與參考方法具有較好的一致性[11-12],但目前在國內(nèi)僅限科研用途。半自動藥敏板條操作簡便,但唑類藥物結(jié)果判讀受主觀因素影響較大。AST-YS08真菌藥敏卡片(以下簡稱AST-YS08卡片)作為一種全自動的真菌藥敏試驗板條,國內(nèi)對其評估較少,因此本研究以基于美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的M27-Ed4[13]的BMD法為金標(biāo)準(zhǔn),評價AST-YS08卡片檢測酵母菌藥物敏感性的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2019年3月29日至2022年5月8日臨床分離的100株酵母菌菌株,其中白色念珠菌15株、光滑念珠菌19株、熱帶念珠菌16株、近平滑念珠菌復(fù)合群18株(包括近平滑念珠菌11株、擬平滑念珠菌3株、似平滑念珠菌4株)、克柔念珠菌8株、新型隱球菌14株、葡萄牙念珠菌4株、挪威念珠菌2株、希木龍念珠菌1株、季也蒙念珠菌1株、皺褶念珠菌1株、解脂念珠菌1株。本實驗經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(B2022-376R)。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1主要儀器 Vitek 2 Compact全自動鑒定藥敏系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)、比濁儀(法國生物梅里埃公司)、Vitek MS質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)、生物安全柜(美國賽默飛公司)、渦旋混勻儀(美國Scientific Industries公司)。

1.2.2主要試劑 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(美國賽默飛公司);VITEK-MS-FA、VITEK-MS-CHCA基質(zhì)、鹽水、VITEK?2 AST-YS08卡片(法國生物梅里埃公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、0.165 mol/L MOPS緩沖液(德國Sigma-Aldrich公司);氟康唑、伏立康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶(中國食品藥品檢定研究院);進口注射用醋酸卡泊芬凈(美國默沙東公司);注射用米卡芬凈鈉(安斯泰來制藥公司)。

1.3實驗方法

1.3.1轉(zhuǎn)種及鑒定 將-80 ℃保存的菌株接種于沙保弱平板二次傳代后,使用Vitek MS質(zhì)譜儀進行鑒定。用于BMD法檢測的念珠菌于35 ℃需氧條件下培養(yǎng)24 h、新型隱球菌于35 ℃需氧條件下培養(yǎng)48 h。用于AST-YS08卡片檢測的所有菌株按說明書要求,于35 ℃需氧條件下培養(yǎng)18～96 h。

1.3.2BMD法 按照CLSI M27-Ed4[13]文件規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)化方法操作?？咕幬餄舛确秶罁?jù)AST-YS08卡片可報告范圍配制,分別為:米卡芬凈0.06～8.00 μg/mL,卡泊芬凈0.125～16.000 μg/mL,伏立康唑0.25～32.00 μg/mL,兩性霉素B 0.125～16.000 μg/mL,氟康唑0.5～64.0 μg/mL,5-氟胞嘧啶1～64 μg/mL。念珠菌在35 ℃條件下孵育24 h后讀取藥敏結(jié)果,新型隱球菌在35 ℃條件下孵育72 h后讀取結(jié)果。

1.3.3AST-YS08卡片檢測 按照該試劑說明書進行操作。

1.3.4試劑質(zhì)量控制及重復(fù)性檢測 使用近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258對BMD法及AST-YS08卡片進行質(zhì)量控制檢測。采用“3×5”的檢測方案,即使用質(zhì)控菌株連續(xù)測試5 d,每日3次,驗證該藥敏卡片的重復(fù)性。

1.3.5收集數(shù)據(jù) 統(tǒng)計兩種檢測方法的檢測時長、基本一致率(EA)和分類一致率(CA)。EA指兩種方法測得的MIC值相差不超過2個濃度梯度占總測定數(shù)據(jù)的百分比。CA指兩種方法的判定結(jié)果一致(均為敏感、中介或耐藥)的菌株占總測定數(shù)據(jù)的百分比。顯著錯誤(VME)指BMD法MIC值判定為耐藥而AST-YS08卡片判定為敏感;大錯誤(ME)指BMD法MIC值判定為敏感而AST-YS08卡片判定為耐藥;小錯誤(MiE)指一種方法MIC值判定為中介或劑量依賴性敏感(SDD)而另外一種方法判定為敏感或耐藥。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)控 質(zhì)控菌株檢測相應(yīng)藥物測得的MIC值均在規(guī)定范圍內(nèi)。重復(fù)性試驗檢測AST-YS08卡片符合率≥90%,符合CNAS-CL02-A005要求。

2.2EA 根據(jù)兩種方法測得的MIC值計算EA(表1)。檢測念珠菌時AST-YS08卡片與BMD法的總EA為87.2%。統(tǒng)計不同藥物MIC50和MIC90發(fā)現(xiàn),除AST-YS08卡片測得的卡泊芬凈MIC90比BMD法高2個梯度外,其余藥物的MIC50、MIC90與BMD法結(jié)果相差均在1個梯度內(nèi)。兩種方法測得卡泊芬凈MIC值大于1個濃度梯度的菌株共38株,除1株皺褶念珠菌外,其余97.4%菌株(光滑念珠菌13株、近平滑念珠菌復(fù)合群12株、克柔念珠菌8株、其他念珠菌5株)AST-YS08卡片檢測的卡泊芬凈MIC值均偏高。檢測培養(yǎng)24 h和48 h的新型隱球菌,AST-YS08卡片與BMD法的總EA分別為96.3%和100.0%。AST-YS08卡片測得的所有藥物MIC50、MIC90與BMD法檢測結(jié)果相差均在1個梯度內(nèi),且對培養(yǎng)24 h和48 h的新型隱球菌,AST-YS08卡片與BMD法的EA比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.495)。

表1 AST-YS08卡片與BMD法檢測酵母菌藥物敏感性的MIC和EA

2.3CA與敏感性判定錯誤率 參考CLSI酵母菌敏感性折點及流行病學(xué)折點文件,計算CA、VME、ME及MiE的數(shù)量和占比,其中分類不一致的菌株及藥物見表2。AST-YS08卡片與BMD法的總體CA較高,對近平滑念珠菌復(fù)合群及培養(yǎng)48 h的新型隱球菌兩種方法的CA為100.0%。所有藥物中,檢測卡泊芬凈時兩種方法的CA最低(光滑念珠菌:CA為5.3%;克柔念珠菌:CA為0.0%;其他念珠菌:CA為83.3%),且AST-YS08卡片 MIC值明顯高于BMD法。

表2 AST-YS08卡片與BMD法檢測酵母菌藥物敏感性分類不一致菌株的CA及敏感性判定錯誤率

2.4不同酵母菌之間EA、CA比較 臨床常見的酵母菌AST-YS08卡片檢測與BMD法的總EA從高到低依次是新型隱球菌(48 h)100.0%、白色念珠菌97.8%、新型隱球菌(24 h)96.3%、熱帶念珠菌87.5%、近平滑念珠菌復(fù)合群85.2%、光滑念珠菌和克柔念珠菌均為83.3%。上述6種酵母菌AST-YS08卡片檢測與BMD法檢測的總CA從高到低依次是新型隱球菌(48 h)及近平滑念珠菌復(fù)合群均為100.0%、白色念珠菌98.7%、新型隱球菌(24 h)92.6%、熱帶念珠菌87.5%、光滑念珠菌76.8%、克柔念珠菌75.0%。培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24 h的新型隱球菌AST-YS08卡片檢測與BMD法的CA比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.118)。

2.5體外藥敏試驗時長分析

2.5.1念珠菌檢測時長 CLSI M27-Ed4規(guī)定的念珠菌BMD法檢測所需時長為24 h。AST-YS08卡片檢測念珠菌時長為(13.63±2.55)h,其中熱帶念珠菌[(12.25±0.75)h]、光滑念珠菌[(12.54±1.32)h]、白色念珠菌[(12.60±0.77)h]檢測時間較短,而克柔念珠菌[(14.61±1.53)h]、近平滑念珠菌復(fù)合群[(14.82±1.07)h]檢測時間較長。AST-YS08卡片檢測時間比BMD法縮短了約43.2%,檢測速度明顯提高(P<0.05)。

2.5.2新型隱球菌檢測時長 CLSI M27-Ed4規(guī)定的新型隱球菌BMD法檢測所需時長為70～74 h。AST-YS08卡片對于培養(yǎng)48 h的新型隱球菌檢測時長為(20.67±5.13)h,培養(yǎng)24 h的菌株檢測時長為(20.31±5.84)h,AST-YS08卡片對兩種培養(yǎng)時間的新型隱球菌檢測時長比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.970)。但AST-YS08卡片檢測時間比BMD法縮短了約71.5%,檢測速度明顯提高(P<0.05)。

3 討 論

使用AST-YS08卡片檢測各類念珠菌及多種抗真菌藥物時EA均較高,臨床常見的5類念珠菌AST-YS08卡片檢測與BMD法檢測的EA均>80.0%,其中兩種方法檢測白色念珠菌的EA最高,為97.8%,熱帶念珠菌為87.5%、近平滑念珠菌復(fù)合群為85.2%,而兩種方法檢測光滑念珠菌和克柔念珠菌EA較低,為83.3%,與HYEYOUNG等[14]研究結(jié)果類似。對于各類藥物EA的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),除氟康唑為86.0%、卡泊芬凈為55.8%外,其余藥物兩種方法的EA均>90.0%。BURCU等[15]評估了140株念珠菌,與本研究結(jié)果接近。而對于卡泊芬凈,CRETELLA等[16]研究3種檢測方法后發(fā)現(xiàn),相較于Etest法、Sensititre YeastOne,AST-YS08卡片表現(xiàn)更加出色(EA>90%)。

檢測念珠菌時AST-YS08卡片與BMD法分類不一致的情況主要集中在氟康唑、伏立康唑和卡泊芬凈。如AST-YS08卡片檢測卡泊芬凈出現(xiàn)“中介”或“耐藥”,應(yīng)謹慎報告。本實驗唑類藥物結(jié)果與RICARDO等[17]、MANUEL等[18]研究結(jié)果類似。后者檢測了154株臨床標(biāo)本分離株,發(fā)現(xiàn)Vitek 2藥敏系統(tǒng)檢測氟康唑、伏立康唑,均有少量的VME檢出。有研究指出,如念珠菌出現(xiàn)卡泊芬凈“中介”或“耐藥”,需檢測米卡芬凈/阿尼芬凈,對FKS基因進行DNA序列,或?qū)⒕晁椭羺⒈葘嶒炇疫M行確認。若對阿尼芬凈或米卡芬凈耐藥,或存在FKS熱點突變,則認為對所有棘白菌素耐藥[11]。本實驗數(shù)據(jù)提示,AST-YS08卡片檢測光滑念珠菌、克柔念珠菌時對卡泊芬凈結(jié)果不理想,數(shù)篇文獻研究同樣發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈體外藥敏試驗與CLSI標(biāo)準(zhǔn)的BMD法間存在差異[14,19-20],后續(xù)可就該卡片卡泊芬凈檢測MIC值偏高的原因進一步研究。

另外,AST-YS08卡片檢測范圍不包含擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌。CLSI指出如能明確區(qū)分為似平滑念珠菌或擬平滑念珠菌,則應(yīng)使用相應(yīng)折點而非近平滑念珠菌的折點[11]。近年來近平滑念珠菌感染率逐漸上升,已成為第二或第三位較常見的臨床分離念珠菌[21]。有研究指出,似平滑念珠菌和擬平滑念珠菌也可引起血流感染[22]。隨著鑒定技術(shù)的發(fā)展,近平滑念珠菌復(fù)合群已經(jīng)可以被細分到3類不同的念珠菌,而Vitek 2藥敏系統(tǒng)并未設(shè)置“似平滑念珠菌”“擬平滑念珠菌”的選項,且AST-YS08卡片的伏立康唑濃度范圍也不能覆蓋似平滑念珠菌折點,有待改進。

AST-YS08卡片檢測新型隱球菌時與BMD法的EA較高,且檢測培養(yǎng)48 h的新型隱球菌或比培養(yǎng)24 h表現(xiàn)更好。本實驗檢測培養(yǎng)24 h和48 h的新型隱球菌總EA分別為96.3%和100.0%,唑類藥物EA均為100.0%,與LEONARDO等[22]、MIN等[23]研究結(jié)果相近。同時,本實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24 h的新型隱球菌菌株兩性霉素B AST-YS08卡片檢測與BMD法檢測的CA為78.6%,ME%為21.4%,較培養(yǎng)48 h的新型隱球菌菌株CA更低。本研究還發(fā)現(xiàn),1株培養(yǎng)24 h的新型隱球菌菌株AST-YS08卡片檢測兩性霉素B、5-氟胞嘧啶均比BMD法升高了3個稀釋梯度。另外,使用AST-YS08卡片檢測其中1株新型隱球菌菌株時,部分藥物出現(xiàn)陽性對照孔生長不充分導(dǎo)致無MIC值的情況,培養(yǎng)48 h時有2種藥物無結(jié)果,培養(yǎng)24 h時有4種藥物無結(jié)果。由于菌株數(shù)量限制,暫未在該卡片檢測培養(yǎng)24 h和培養(yǎng)48 h新型隱球菌的性能方面發(fā)現(xiàn)明確差異,可作為后續(xù)方向進一步研究。

本實驗共選取了該卡片使用范圍內(nèi)的多種念珠菌(共計13種,86株)以及新型隱球菌(共14株),包括了酵母菌感染的主要病原體種類。但數(shù)種少見酵母菌未評估,例如西弗念珠菌、杜氏念珠菌、產(chǎn)朊念珠菌等,因此對于這些念珠菌,AST-YS08卡片的檢測性能還不明確。另外本院未收集到對棘白菌素類耐藥的念珠菌,所以無法評估卡泊芬凈、米卡芬凈對于耐藥菌株MIC檢測的性能。

綜上所述,AST-YS08卡片操作簡便,檢測時長短,適用范圍廣,抗真菌藥物種類全面,檢測念珠菌時,絕大部分藥物與BMD法的EA、CA較高。新型隱球菌培養(yǎng)48 h后進行檢測,所有藥物AST-YS08卡片與BMD法的EA、CA均>90.0%;縮短新型隱球菌培養(yǎng)時間至24 h時,AST-YS08卡片檢測與BMD法的EA、CA有所下降,但與培養(yǎng)48 h的結(jié)果無明顯差異。然而AST-YS08卡片未能區(qū)分近平滑念珠菌復(fù)合群中的3種念珠菌,且伏立康唑檢測范圍不能覆蓋似平滑念珠菌折點。因此AST-YS08卡片適合在臨床實驗室中應(yīng)用于酵母菌體外藥物敏感性檢測,但對于念珠菌對卡泊芬凈非敏感結(jié)果需謹慎報告,似平滑念珠菌對伏立康唑的藥物敏感性需使用其他方法檢測。