IL-4/STAT6通路相關基因對Graves病患者外周血B淋巴細胞水平的影響*

楊 倩,查兵兵

復旦大學附屬上海市第五人民醫院內分泌科,上海 200240

Graves病是器官特異性自身免疫性甲狀腺疾病,患病率約為1%[1]。目前認為抑制性免疫細胞功能的減弱[2],以及輔助性T淋巴細胞和B淋巴細胞功能的增強[3],導致Graves病致病性抗體促甲狀腺素受體抗體(TRAb)的產生。本課題組既往研究顯示CD20+B淋巴細胞在Graves病患者甲狀腺組織中浸潤[3],占Graves病甲狀腺淋巴細胞的9%左右,外周血CD19+B淋巴細胞也顯著增加[4]。但目前Graves病B淋巴細胞增多機制還有待進一步研究。

白細胞介素-4(IL-4)主要由活化T細胞產生,通過促甲狀腺激素受體(THSR)免疫野生型(WT)、IL-4基因敲除的老鼠發現,只有IL-4基因敲除的老鼠不易發展成為Graves病,證實IL-4在Graves病發生中的重要作用[5]。而Graves病患者血清IL-4水平與健康人對比目前存在爭議,結果不一致[6-7]。此外IL-4對于B淋巴細胞免疫調節起著重要的作用。促進B淋巴細胞增殖是IL-4被識別的第一個生物學功能[8]。后續研究還發現IL-4可促進前B淋巴細胞分化為成熟B淋巴細胞,拮抗Fas介導的B淋巴細胞凋亡,延長B淋巴細胞的壽命,促進B淋巴細胞抗體類別轉換以及促進主要組織相容性復合物(MHC)-Ⅱ生成,增強抗原遞呈等[8-10]。IL-4在B淋巴細胞中的轉錄調控作用依賴信轉導和轉錄激活因子6(STAT6)信號[11]。STAT6屬于信號轉導子和轉錄激活子家族一員,在B淋巴細胞發育、分化以及抗體類別轉化中也起著重要的作用[12]。目前IL-4/STAT6通路相關基因對Graves病患者外周血B淋巴細胞的影響尚不清楚。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年1-6月在上海市第五人民醫院門診及病房初發、未使用過抗甲狀腺藥物治療的Graves病患者20例作為Graves病組,其中男8例、女12例,年齡21～78歲、平均(42.0±2.8)歲。選擇同期在上海市第五人民醫院體檢健康且性別、年齡匹配的20例健康者作為健康對照組。Graves病的診斷依據美國甲狀腺協會(ATA)2016年相關指南[13]。排除標準:(1)甲狀腺炎及其他可引起甲狀腺素水平升高的疾病;(2)近期服用過胺碘酮及其他可影響甲狀腺功能的藥物;(3)妊娠期女性;(4)患嚴重心腦血管疾病,肝、腎衰竭,腫瘤,急性感染,慢性炎癥性疾病,其他自身免疫性疾病。

1.2儀器與試劑 羅氏 Cobas 800全自動生化免疫分析儀,Beckman Counter CyAn流式細胞儀。Human BD Fc BlockTM購自BD Biosciences公司,anti-human CD19購自Biolegend公司,anti-hu/mo pSTAT6購自Ebioscience公司,anti-human IL-4R購自Biolegend公司,RNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自TaKaRa公司,IL-4 ELISA試劑盒購自Abcam公司。

1.3方法 所有研究對象采血前禁食12 h,并于次日清晨8點采血,抽取3 mL于采血管中,每人采血2管。(1)甲狀腺功能及甲狀腺抗體檢測:取3 mL外周血送上海市第五人民醫院檢驗科檢測甲狀腺功能[游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素 (FT4)]、甲狀腺抗體[甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、TRAb]。TRAb是Graves病生化診斷指標,健康對照組未檢測該抗體。(2)流式檢測CD19+B淋巴細胞、IL-4受體(IL-4R)和pSTAT6:取3 mL外周血于EDTA抗凝管中,根據密度梯度離心法獲得單個核細胞。向細胞懸液中加入Fc Block 抗體,4 ℃ 孵育 15 min,再加入熒光抗體anti-human CD19、 anti-hu/mo pSTAT6、anti-human IL-4R,4 ℃ 避光孵育 0.5 h。洗去未與細胞表面抗原結合的抗體后重懸細胞,上機檢測IL-4R、CD19+B淋巴細胞水平。將表染后的細胞用PBS 洗滌后加入穿核液,4 ℃ 孵育45 min。再予Perm 洗滌細胞加入含熒光抗體的Perm,4 ℃ 避光孵育 40 min。一管加入Perm洗去未與細胞核內分子的抗體,再重懸細胞,上機進行pSTAT6流式檢測。(3)IL-4R mRNA檢測:為驗證RNA-seq芯片數據的可靠性,通過磁珠分選8例Graves病患者和5例健康者外周血B淋巴細胞進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測驗證IL-4R mRNA表達。使用TRIzol試劑提取總RNA,并按照說明書反轉錄為cDNA。引物設計和合成由捷瑞生物公司完成,以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內參。RT-PCR檢測嚴格按照說明書進行操作。RT-PCR反應條件如下:95 ℃ 30 s預變性,95 ℃ 5 s,55 ℃ 34 s,40個循環;95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCt計算IL-4R mRNA的水平。(4)ELISA檢測IL-4:按照人IL-4 ELISA試劑盒操作步驟進行,最后根據標準物濃度與吸光度(A)計算出標準曲線的直線方程,將A代入方程式,計算出濃度,再根據稀釋倍數,算出實際濃度。

2 結 果

2.1兩組甲狀腺功能、甲狀腺抗體比較 與健康對照組比較,Graves病組FT3、FT4、TPOAb、TGAb水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組甲狀腺功能、甲狀腺抗體水平比較[M(P25,P75)或

2.2兩組CD19+B淋巴細胞比例和IL-4R水平比較 Graves病組外周血CD19+B淋巴細胞比例為(7.74±2.68)%,高于健康對照組的(3.38±1.59)%,差異有統計學意義(t=6.235,P<0.05)。Graves病患者B淋巴細胞IL-4R mRNA的水平為3.415±0.813,高于健康者的1.037±0.210,差異有統計學意義(t=5.747,P<0.05)。mRNA芯片原始文件可從GEO數據庫(編號GSE136709)獲取,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE136709。

2.3兩組IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴細胞和CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平比較 Graves病組血清IL-4水平及外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與健康對照組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清IL-4及外周血CD19+IL-4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞組間比較或M(P25,P75)]

2.4IL-4、CD19+IL4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞與Graves病患者甲狀腺功能及甲狀腺抗體相關性分析 相關性分析顯示,Graves病IL-4、CD19+IL4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與甲狀腺功能(FT3、FT4)、甲狀腺抗體(TPOAb、TGAb、TRAb)均無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 IL-4、CD19+IL-4R+和CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與Graves病甲狀腺功能及甲狀腺抗體之間的相關性

3 討 論

Graves病的病因目前尚未完全闡明,現認為其發病與遺傳、精神因素、自身免疫系統密切相關,是多種因素共同作用的結果[14]。B淋巴細胞是Graves病自身抗體TRAb的來源,在Graves病患者外周血和甲狀腺組織中均顯著增加。當前研發針對B淋巴細胞的藥物以期從根本上阻斷Graves病異常免疫應答,成為Graves治療的新方向[15]。可以說B淋巴細胞在Graves病發生和治療中均發揮著重要的作用。

Graves病是以Th2免疫為主的器官特異性自身免疫性疾病,而IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子,在Graves病患者甲狀腺組織中高表達[16]。B淋巴細胞的增殖、分化需要多種細胞因子和轉錄因子協同作用。目前研究發現IL-4依賴STAT6在B淋巴細胞增殖、延長B淋巴細胞生存周期及減少B淋巴細胞凋亡中發揮著重要的作用[9]。IL-4在B淋巴細胞中的轉錄調控很大程度上依賴于STAT6。即IL-4與IL-4R結合后,激活Jak1和Jak3激酶,而后使得STAT6磷酸化(pSTAT6),磷酸化的STAT6形成二聚體進入細胞核參與目的基因的轉錄[17]。本課題組既往研究證實了TRAb刺激甲狀腺細胞后導致甲狀腺細胞自分泌IL-4,IL-4與IL-4R結合促進STAT6磷酸化,再通過促進增生相關基因Bcl-xL、Cyclin D1表達,來促進甲狀腺濾泡上皮細胞增生,導致Graves病的發生[18]。IL-4/STAT6對B淋巴細胞生發中心的形成和抗體類別轉換至關重要[19],但目前IL-4/STAT6對B淋巴細胞增殖、分化尚不清楚。雖然IL-4對Graves病的發病和B淋巴細胞的增殖起著重要的作用,但本研究發現血清IL-4水平在Graves病組和健康對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。

本課題組mRNA表達譜芯片結果顯示參與激活B淋巴細胞增殖的IL-4R mRNA在Graves病患者B淋巴細胞中上調,并且PCR驗證IL-4R mRNA在Graves病患者外周血B淋巴細胞中顯著增加,但流式細胞術檢測顯示外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平在Graves病組和健康對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。STAT6作為重要的轉錄因子,參與細胞的增殖、分化以及免疫調節等許多重要的生物學效應,缺乏會導致B淋巴細胞免疫功能受損、糖酵解能力降低以及細胞形態改變,導致各種疾病的發生、發展。STAT6的活化需要IL-4介導,本課題組猜想外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平在Graves病組和健康對照組間無明顯差異可能是因為本研究納入的樣本量小,Graves病組和健康對照組間血清IL-4水平無差異所致,本課題組后續將擴大樣本量進行深入探討。甲狀腺微環境下CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平尚不明確,后續需要動物實驗進行驗證。經過相關性分析發現,IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與甲狀腺功能和甲狀腺抗體均無相關性。雖然B淋巴細胞和IL-4/STAT6通路在Graves病的發生、發展中起著重要作用,但IL-4/STAT6通路相關基因并不能反映Graves病的疾病狀態。

綜上所述,Graves病患者外周血B淋巴細胞顯著增加,IL-4/STAT6信號通路相關基因可能并不影響Graves病患者外周血B淋巴細胞增殖和Graves病的疾病狀態。