多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒病原菌檢測中的應(yīng)用

劉水 孫建飛

摘要：目的 探討多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒病原菌檢測中的應(yīng)用效果，為食物中毒患者爭取治療時間，確保飲食安全。方法 選取2020年5月～2022年5月期間在本市懷柔區(qū)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行食物中毒病原菌檢測的54例患者為對象，對其提供的嘔吐物、糞便等60份樣本進(jìn)行病原菌檢驗，通過對主要致病菌研究，建立PCR檢測體系，分析與比較常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）與多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒中檢測應(yīng)用價值。結(jié)果 檢出54例患者為食源性食物中毒，引發(fā)食物中毒的致病菌有沙門氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌。沙門氏菌感染食物中毒22例（占40.74%），變形桿菌感染食物中毒9例（占16.67%），金黃色葡萄球菌感染食物中毒12例（占22.22%），蠟樣芽胞桿菌感染食物中毒11例（占20.37%）。從感染病菌類型看，感染型細(xì)菌引起的中毒人數(shù)明顯高于毒素型細(xì)菌中毒人數(shù)（P＜0.05）；所有患者致病菌經(jīng)常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測與多重?zé)晒舛縋CR試劑盒檢測，兩種檢測結(jié)果均一致，檢出率為100%。多重?zé)晒舛縋CR的基因組DNA檢測靈敏度只有2×10-6 ng/?l，常規(guī)PCR檢測敏感度為2×10-7 ng/?l，常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測能更為準(zhǔn)確地檢測患者食物中的多種致病菌，但需消耗大量的試劑且所需的檢測時間長，多重?zé)晒舛縋CR檢測所需試劑少且所需檢測時間短，但其檢測靈敏度較低。結(jié)論 多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒中應(yīng)用價值明顯，4種食物致病菌可以在一次檢測種被查出，但其靈敏度低于常規(guī)PCR檢測，可將兩者取長補短，在食物中毒致病菌檢測工作中推廣應(yīng)用，保證人們食品食用安全。

關(guān)鍵詞：多重?zé)晒舛縋CR；常規(guī)PCR；致病菌；食物中毒

食物中毒是指健康人食用被細(xì)菌、毒素及有毒物質(zhì)污染的食物所致的急性感染疾病。在臨床上，該病患者多表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉及腹痛等癥狀，嚴(yán)重者還可出現(xiàn)肢體無力、神經(jīng)麻木，甚至休克昏迷等，若不及時給予患者針對性干預(yù)治療，會對其生命安全造成嚴(yán)重威脅[1～2]。食物中毒事件事發(fā)突然，發(fā)病者通常涉及群體且影響較大，需要快速準(zhǔn)確找出病癥根源，以便及時對患者干預(yù)治療。目前，對食物中毒檢測方法很多，包括血常規(guī)檢查、糞便檢查及病原學(xué)檢查等。常規(guī)檢測方法需對樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，不僅操作復(fù)雜，還需要花費大量的時間，且檢測過程中樣本易受到污染，難以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)檢測方法的不足，特別是多重PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用，是在原有PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，實現(xiàn)了多種食源性致病菌的同時檢測。有研究顯示，多重?zé)晒舛縋CR檢測應(yīng)用于食物中毒中，提高了檢測效率[3]。本研究旨在探討多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒病原菌檢測中的應(yīng)用效果。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

2720 Thermal Cycler熱循環(huán)儀（由美國Life Technologies提供）、DYY-6C電泳儀（由北京六一儀器廠提供）、Centri-Fuge FRESCO 17 低溫高速離心機（由美國Therrmo提供）、HDLⅡ生物安全柜（由北京東聯(lián)提供）、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱（由上海博迅提供）、Image Quant 300凝膠成像系統(tǒng)及超純水系統(tǒng)（由美國Millipore提供）。

1.1.2 試劑

實驗試劑有Tap酶、PCR及Mg2+細(xì)胞裂解緩沖液（均為Promega公司提供）、瓊脂糖DNA 純化試劑盒（由青島生工生物科技有限公司提供）、DL2000TM DNA Marker與100bp DNA Ladder Marker（均由大連寶生物工程TaKaRa有限公司提供）及溴化乙錠（由美國Gibco公司提供）。

1.1.3 菌株

實驗室所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株均為本疾控中心提供，并保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

參照GB/T4789.1-2008對現(xiàn)場采集的食物中毒的樣本中細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 PCR引物設(shè)計

對細(xì)菌基因組的DNA提取，主要采用相關(guān)試劑盒提取，按照試劑盒操作說明書嚴(yán)格執(zhí)行，保存于-20℃?zhèn)溆?。之后以?xì)菌的基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank中6種食源性致病菌的序列，分析液體序列后篩選出靶序列，然后根據(jù)靶序列利用設(shè)計的引物對目的基因片段擴增。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer solution 2.5 ?l，2?lDNA模板，引物1?l，dNTP為0.5 ?l，Taq DNA 聚合酶為0.5?l，ddH2O為17.5 ?l。PCR反應(yīng)單循環(huán)條件參數(shù)：預(yù)變性95℃ 3 min，反應(yīng)35個循環(huán)，每個循環(huán)變性94℃ 30 s，退火58℃ 1 min，延伸72℃ 1 min；循環(huán)結(jié)束后延伸72℃ 10 min，直到冷卻為16℃，產(chǎn)物4℃保存后備用。取5 ?l PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（3%）與紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察最后的結(jié)果，PCR反應(yīng)的退火溫度為50℃～62℃，根據(jù)電泳圖帶的亮度選擇合適的退火溫度，其余PCR其余置入4℃保存留用。

1.2.3 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)

基于單一PCR反應(yīng)后，對多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，其相關(guān)體系中除了引物0.5 ?l外，其余均一樣。多重PCR反應(yīng)單循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃ 3 min，反應(yīng)40個循環(huán)，每個循環(huán)變性94℃ 30 s，退火62℃ 1 min，延伸72℃ 1 min；循環(huán)結(jié)束后延伸72℃ 10 min，直到冷卻為16℃，產(chǎn)物4℃保存后備用。取5 ?l PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（3%）與紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察最后的結(jié)果，PCR反應(yīng)的退火溫度為48℃～72℃，根據(jù)電泳圖帶的亮度選擇合適的退火溫度，其余PCR產(chǎn)物置入4℃保存留用。在此檢測過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作與標(biāo)準(zhǔn)化采集方式，按照儀器與試劑盒操作說明執(zhí)行。

1.2.4 常規(guī)PCR與多重?zé)晒釶CR反應(yīng)靈敏度比較

測定樣品中致病菌菌株基因組DNA的濃度，將其調(diào)整到20 ng/?l，按照10被梯度稀釋，靈敏度的試驗的DNA濃度為2×10-2×10-10 ng/?l，每個濃度的DNA各取2 ?l后進(jìn)行常規(guī)PCR與多重?zé)晒釶CR反應(yīng)靈敏度的比較實驗，以此獲得結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以（±s）表示，采用ｔ檢驗，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗，（P＜0.05）為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 食物中毒致病菌檢出情況

54例患者均為食源性食物中毒，引發(fā)食物中毒的致病菌有沙門氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌4種。沙門氏菌感染食物中毒者最多，其次為變形桿菌感染食物中毒者。感染型細(xì)菌引起的中毒人數(shù)明顯高于毒素型細(xì)菌中毒人數(shù)（P＜0.05）。見表1。

2.2 常規(guī)PCR與多重?zé)晒釶CR反應(yīng)靈敏度比較

用兩種PCR同時擴增進(jìn)10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，常規(guī)PCR在DNA的量低至2×10-7 ng/?l時可擴增出清晰特異性的目的條帶，多重?zé)晒舛縋CR在2×10-1 ng/?l可擴增出金黃色葡萄球菌、蠟樣要胞桿菌，在2×10-3 ng/?l時只能擴增出前者金黃色葡萄球菌，后者則不能擴增出，當(dāng)基因組DNA濃度達(dá)到最大濃度時金黃色葡萄球菌 擴增不出來，以此確定出常規(guī)PCR檢測敏感度為2×10-7 ng/?l，而多重?zé)晒舛縋CR靈敏度只有2×10-6 ng/?l。所有患者致病菌經(jīng)常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測與多重?zé)晒舛縋CR試劑盒檢測，兩種檢測結(jié)果均一致，檢出率為100%。

3討論

食品安全關(guān)系到人們身體康健與基本社會生產(chǎn)活動的正常開展，一直以來受到各界人士的廣泛關(guān)注[4]。近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展水平的提高，一些企業(yè)與商家為了自身利益，在食品原料生產(chǎn)加工過程中被細(xì)菌污染的風(fēng)險提高，而這些致病菌種類較多，不但會給企業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，還會危害人們的生命安全。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查報告顯示[5]，全球每年因食物中毒而死亡的約有42萬人，約5500萬人因食源性因素造成腹瀉，其中因腹瀉死亡約23萬人。目前，引起食源性致病菌種類達(dá)300種，對這些致病菌的檢測，是保障食品安全的最基本的要求，而如何快速準(zhǔn)確檢測出致病菌是當(dāng)前相關(guān)結(jié)構(gòu)開展工作的難點[6]。

現(xiàn)階段，對食物中毒人員病原菌的檢測方法有許多，傳統(tǒng)的診斷辦法是對患者糞便、嘔吐物等進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)觀察，最后得出檢測結(jié)果。該檢測方法耗時較長，且所使用的實驗檢測資源耗費量大，加上在檢測過程中容易受到污染，易造成結(jié)果不準(zhǔn)確等問題，在一定程度耽誤了患者最佳治療時機。而實施熒光定量PCR是在定性PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的核酸定量技術(shù)，通過利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，該檢測方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高、特異性強、操作簡便及快速等特點，在食源性致病菌監(jiān)測中應(yīng)用效果良好[7～9]。

本研究結(jié)果顯示，54例患者均為食源性食物中毒，引發(fā)食物中毒的致病菌有4種，分別為沙門氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌。從感染病菌類型看，感染型細(xì)菌引起的中毒人數(shù)明顯高于毒素型細(xì)菌中毒人數(shù)（P＜0.05）。對所有患者進(jìn)行致病菌經(jīng)常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測與多重?zé)晒舛縋CR試劑盒檢測，兩種檢測結(jié)果均一致，檢出率為100%。多重?zé)晒舛縋CR的基因組DNA檢測靈敏度只有2×10-6 ng/?l，常規(guī)PCR檢測敏感度為2×10-7 ng/?l，常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測能更為準(zhǔn)確的檢測患者食物中的多種致病菌，但需消耗大量的試劑且所需的檢測時間長，多重?zé)晒舛縋CR檢測所需試劑少且所需的檢測時間短，但其檢測靈敏度較低。這是由于多種熒光定量PCR監(jiān)測是基于常規(guī)PCR基礎(chǔ)上衍生出的多種分子生物學(xué)方法，通過利用兩對或兩對以上的引物及熒光標(biāo)記探針對多個目標(biāo)序列同時監(jiān)測，該方法克服了常規(guī)PCR的不足，可縮短檢測周期，減少成本，提高效率，在食物中毒中應(yīng)用價值明顯。

綜上所述，多重?zé)晒舛縋CR試劑盒在食物中毒中應(yīng)用價值明顯，4種食物致病菌可以在一次檢測種被查出，但其靈敏度低于常規(guī)PCR檢測，可將兩者取長補短，在食物中毒致病菌檢測工作中推廣應(yīng)用，保證人們食品食用安全。

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