西藏曲拉中優(yōu)良乳酸菌的篩選與評(píng)價(jià)

呂嘉偉，盧灝澤，劉振東，薛 蓓，王妍凌，楊冬瑩，張海鵬，張金萍，黃 翠，薛 潔

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；3.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015；4.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712082；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

西藏曲拉為藏族傳統(tǒng)奶酪[1]，是以西藏特色畜產(chǎn)品牦牛產(chǎn)生的牦牛乳為原料制備而成，由于其自然發(fā)酵的特性，曲拉中存在豐富的微生物資源，但由于缺乏工業(yè)化生產(chǎn)的條件，曲拉大部分以家庭手工式生產(chǎn)，生產(chǎn)規(guī)模較小、品質(zhì)控制較難，限制了當(dāng)?shù)厍a(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。適當(dāng)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，在保留其原有風(fēng)味的基礎(chǔ)上，保證曲拉的安全性，使曲拉的外表更美、品質(zhì)更佳，可在一定程度上加快西藏曲拉的推廣。

將鮮乳生產(chǎn)成各類發(fā)酵乳制品離不開發(fā)酵劑，目前我國乳品企業(yè)所用的菌株大多需要進(jìn)口，我國的益生菌開發(fā)應(yīng)用起步較晚，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的菌種較少。傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中含有豐富的微生物資源，其中不乏具有優(yōu)良性狀的菌株，因此自然發(fā)酵乳品有一定的開發(fā)潛力。朱建寧等[4]從牦牛曲拉中篩選出的耐久腸球菌（E.durans）具有較好的耐受性，在較高的滲透壓、較高的膽鹽濃度、較低的pH環(huán)境下，生長較為良好，有作為益生菌的潛能；梁竟一等[5]從青海地區(qū)的乳制品中篩選出1 株瑞士乳桿菌（L.helveticus）有較好的抗幽門螺桿菌功效，可作為功能性乳品開發(fā)的專利菌株[5]；劉敏等[6]從內(nèi)蒙古采集的自然發(fā)酵乳中篩選出的酵母菌X4 具有優(yōu)良的耐受性，利用其制作切達(dá)奶酪，可顯著改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性，對(duì)咀嚼性和硬度等均有所提升。

各類乳制品中分離所得的菌種，具有良好性能的菌株可進(jìn)一步開發(fā)利用，以提升品質(zhì)、豐富產(chǎn)品類型[7]。近年來，許多學(xué)者對(duì)內(nèi)蒙古、新疆等地的奶制品進(jìn)行了較為詳盡的研究[9]，相對(duì)而言，對(duì)西藏曲拉的各方面研究較少。本研究對(duì)牦牛曲拉中含有的微生物資源進(jìn)行挖掘，構(gòu)建牦牛曲拉菌種資源庫，篩選具有優(yōu)良性狀、有深入研究價(jià)值與開發(fā)潛力的菌株，為曲拉品質(zhì)提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種、樣品

菌種：大腸埃希氏菌（E.coli）CICC 20234、金黃色葡萄球菌（S.aureus）CICC 10786，由實(shí)驗(yàn)室從菌種保藏中心（CICC）購買。

曲拉樣品：采自西藏各地的牧民家中，采樣時(shí)間為2021 年3 月，所有樣品均為自然發(fā)酵工藝制成。各樣品采集地詳情見表1。

1.1.2 試劑與耗材(表2)

表2 藥品與試劑

1.1.3 儀器設(shè)備(表3)

表3 儀器與設(shè)備

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的分離培養(yǎng)、鑒定

將所有曲拉樣品準(zhǔn)確稱取10 g，單獨(dú)分裝于無菌采樣袋中。酒精燈、接種環(huán)、涂布棒、一次性平板培養(yǎng)皿、具塞試管、1.5 mL 離心管。參照凌代文[14]的方法進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)、鑒定。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵能力測定

凝乳時(shí)間測定：將乳酸菌活化后，按3 %接種量接種于滅菌后的脫脂乳培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵至牛乳組織黏稠，有明顯凝塊，記錄凝乳的時(shí)間。

發(fā)酵乳滴定酸度測定：按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》，測定發(fā)酵乳的滴定酸度，平行測定3次。

發(fā)酵乳后酸度測定：將凝乳后的發(fā)酵乳放置于4 ℃，分別于1 d、7 d、14 d 測定其滴定酸度，平行測定3次。

發(fā)酵乳持水率測定：將凝乳后的發(fā)酵乳放入15 mL 離心管，4000 r/min，離心10 min，棄上清液，按以下公式計(jì)算其持水率，平行測定3次。

持水率=（M2-M0）/（M1-M0）×100%

式中：M0——空離心管的質(zhì)量；

M1——離心前的總質(zhì)量；

M2——棄去上清液后的總質(zhì)量。

1.2.3 乳酸菌耐受性測定

菌株耐鹽性能測定：將NaCl 加入MRS 液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽濃度。液體培養(yǎng)基滅菌后接種菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并測定菌液的吸光值，波長設(shè)定為600 nm。平行測定3次。

菌株耐酸性能測定：將HCl 加入MRS 液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。液體培養(yǎng)基滅菌后接種菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并測定菌液的吸光值，波長設(shè)定為600 nm。平行測定3次。

菌株耐膽鹽性能測定：將牛膽酸鈉加入MRS液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的膽鹽濃度。液體培養(yǎng)基滅菌后接種菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并測定菌液的吸光值，波長設(shè)定為600 nm。平行測定3次。

菌株耐溫度性能測定：將乳酸菌充分活化后，接種于MRS 液體培養(yǎng)基，分別放置于15 ℃、37 ℃、45 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)24 h。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并測定菌液的吸光值，波長設(shè)定為600 nm。平行測定3次。

1.2.4 乳酸菌抑菌能力測定

將大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）活化后，按1 %的接種量接種于LB 固體培養(yǎng)基，充分搖勻后將添加菌液的LB 培養(yǎng)基倒入滅菌后的平板，平板凝固后，用無菌鑷子放置牛津杯，向牛津杯中加入100 μL 活化好的乳酸菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察平板上是否產(chǎn)生抑菌圈，有抑菌圈的測定其直徑長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過分離純化后，共得到42 株乳酸菌，部分菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖、平板照片如圖1、圖2所示。

圖1 乳酸菌PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 部分乳酸菌平板照片

從圖1 可以看出，所有菌株的特異性片段分子量在1500 bp 左右，條帶清晰，表明菌株DNA 提取與PCR擴(kuò)增均成功，可進(jìn)行下一步測序分析。由圖2 可知，乳酸菌在MRS 平板上的菌落較小、形態(tài)為圓形、表面光滑、邊緣整齊、菌落顏色為乳白色，在加了CaCO3的MRS平板上有明顯的溶鈣圈。

表4 顯示了所分離菌株的鑒定結(jié)果，其中腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）11 株、假腸膜明串珠菌（L.pseudomesenteroides）5 株、腸膜明串珠菌右旋葡聚糖亞種（L.mesenteroides subsp.dextranicum）4 株、糞腸球菌（E.faecalis）10 株，植物乳桿菌（L.plantarum）4株、乳酸片球菌（P.acidilactici）4 株、布氏乳桿菌（L.buchneri）2株、類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）2 株，共有5 個(gè)屬、7 個(gè)種，共計(jì)42 株乳酸菌。

表4 乳酸菌序列比對(duì)結(jié)果

圖3 為部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，詳細(xì)顯示了各菌株間的分類關(guān)系，可直觀的看出各菌株間親緣性關(guān)系。在發(fā)育樹中，不同屬的乳酸菌被分為3 個(gè)分支，乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）在同一分支，乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）在同一分支，明串珠菌屬（Leuco-nostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）在同一分支，同一屬不同種的乳酸菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置相近。

圖3 部分菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 乳酸菌發(fā)酵能力

凝乳狀態(tài)是奶酪質(zhì)量最直接的指標(biāo)，凝乳時(shí)間是評(píng)價(jià)乳酸菌性能的重要指標(biāo)，本研究比較了不同乳酸菌的凝乳時(shí)間，結(jié)果如表5所示。

表5 不同菌株的凝乳時(shí)間

將所有乳酸菌接種于脫脂乳中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以篩選發(fā)酵時(shí)間適中的菌株，發(fā)酵時(shí)間過短，菌株產(chǎn)酸過快，發(fā)酵乳的風(fēng)味形成不完全，發(fā)酵時(shí)間過長，菌株產(chǎn)酸能力較弱，雖對(duì)風(fēng)味形成有一定貢獻(xiàn)，卻增加了生產(chǎn)成本[15]。各菌株的凝乳時(shí)間如表5所示，不同菌株的凝乳時(shí)間在13～24 h 之間，一般商業(yè)化乳酸菌制造發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間為6～10 h，是因?yàn)槠浠钚暂^高、且由多種菌復(fù)配而成。因此選取不同菌屬中凝乳時(shí)間較短，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的8 株菌，分別為LZM-1、LZM-5、SNM-5、RKZM-1、RKZM-5、NQM-1、ALM-1、ALM-3，將以上菌株進(jìn)行后續(xù)的滴定酸度測定、持水率測定、耐受性試驗(yàn)、抑菌能力試驗(yàn)。各菌株滴定酸度變化結(jié)果如表6所示。

表6 不同菌株滴定酸度變化 (°T)

表6 為初篩菌株所制備發(fā)酵乳滴定酸度變化情況，結(jié)果顯示，LZM-1、ALM-1、ALM-3、RKZM-5 產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，ALM-3 的后酸化程度較高，貯藏14 d 后滴定酸度增長了34.42°T±2.64°T，后酸化能力較強(qiáng)的菌株不利于酸乳的貯藏。因此，LZM-1、ALM-1、RKZM-5有作為乳制品發(fā)酵劑的潛能。

表7 為初篩菌株所制發(fā)酵乳持水率的變化情況，持水率越高，表示發(fā)酵乳越黏稠，組織狀態(tài)較好。LZM-1、ALM-1、RKZM-5 的持水率在貯藏過程中變化不大，ALM-3 的持水率在貯藏的前7 d 逐步增加，在14 d下降明顯，原因是其酸度不斷上升，酸乳質(zhì)地崩解，持水率下降。

表7 不同菌株持水率變化 （%）

2.3 乳酸菌的生長曲線

在MRS 液體培養(yǎng)基中接種活化好的乳酸菌，將培養(yǎng)基放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。每間隔2 h，利用酶標(biāo)儀測定菌液在600 nm處的吸光值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 初篩菌株的生長曲線

圖4 顯示所有菌株在4 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，OD 值增長迅速，在16 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD 值增長幅度不大，無明顯變化。在達(dá)到穩(wěn)定期后，LZM-1有最高的吸光值，生長最為旺盛，SNM-5 的吸光度值最低，生長情況不如其他菌株。

2.4 乳酸菌耐受性結(jié)果

鹽漬是許多奶酪生產(chǎn)工藝中重要的一步，加鹽可促進(jìn)奶酪內(nèi)部乳清的排出、增加奶酪的硬度，還可以改善奶酪的風(fēng)味，防止雜菌對(duì)奶酪造成污染[16]。因此用于生產(chǎn)奶酪的菌種應(yīng)具有一定的耐鹽性。

圖5 為8 株乳酸菌的耐鹽性能測定結(jié)果，隨著NaCl 濃度的增加，菌株的生長逐漸受到抑制，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株的生長逐漸恢復(fù)。所有菌株都可以在7 % NaCl 環(huán)境下生長，具有一定的耐鹽特性。

圖5 不同菌株耐鹽性能

乳酸菌為發(fā)揮其益生作用，需先經(jīng)過胃，然后在人體腸道內(nèi)定殖，因此需要具有一定的酸耐受性與膽鹽耐受性，商業(yè)化的益生菌必須具有良好耐酸耐膽鹽性能[17]。圖6 為8 株乳酸菌的耐酸性能測定結(jié)果，所有菌株在pH6.5 的條件下生長迅速，在pH4.0的條件下生長受到抑制，但仍能正常生長，在pH3.0、pH2.0 的條件下，所有菌株的OD 值幾乎不增加，菌株不能正常生長。所篩選的8 株乳酸菌均能耐受pH4.0的條件，耐酸性能較為良好。

圖6 不同菌株耐pH性能

圖7 為8 株乳酸菌的耐膽鹽性能測定結(jié)果，膽鹽對(duì)乳酸菌的抑制作用較為明顯，培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.1 %時(shí)，所有菌株的OD 值下降十分迅速，ALM-3、LZM-1、RKZM-1、SNM-5 的生長較好于其他菌株；膽鹽濃度為0.3%時(shí)，RKZM-5 的OD 值尚有增加；膽鹽濃度為0.5%時(shí)，所有菌株的OD 值增長均不明顯。通常人體腸道內(nèi)含有0.3%以下的膽鹽。所有菌株都可耐受0.1 %濃度的膽鹽，具有一定的膽鹽耐受性。

圖7 不同菌株耐膽鹽性能

在乳制品的生產(chǎn)發(fā)酵過程中，根據(jù)產(chǎn)品需要設(shè)定相應(yīng)的發(fā)酵溫度，部分菌株的發(fā)酵溫度較高，因此乳酸菌對(duì)較高的溫度應(yīng)有一定耐受性，在奶酪的成熟過程中，貯藏室的溫度較低，乳酸菌應(yīng)該在較低溫度下可以正常生長[18]。如圖8 所示，所有菌株在45 ℃下均可正常生長，但其活性不如生長在37 ℃的菌株。LZM-5、RKZM-5 在15 ℃生長較為緩慢，其余菌株在15 ℃生長初期較為緩慢，延滯期較長，在12～24 h 時(shí)生長速度加快，最終生長良好。綜上所示，所有乳酸菌在37 ℃下生長良好，在45 ℃也可正常生長，在15 ℃下LZM-5、RKZM-5生長十分緩慢，其他菌株可正常生長。

圖8 不同菌株在不同溫度的生長情況

2.5 乳酸菌抑菌能力

奶酪在成熟貯藏等過程中，需要存放較長時(shí)間，在此期間內(nèi)易受各種雜菌污染，奶酪中的乳酸菌具有天然的抑菌效果，可有效抑制各種致病菌的生長，以保證奶酪在貯藏期間的安全性[19]。本研究分析了8 株乳酸菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果如表8所示。

表8 乳酸菌抑菌圈直徑 (mm)

由表8、圖9 顯示，乳酸菌的抑菌圈直徑越大，對(duì)致病菌的抑制效果越好。8株乳酸菌都對(duì)最常見的兩種致病菌有一定的抑制效果。植物乳桿菌LZM-1和ALM-1，布氏乳桿菌ALM-3對(duì)這兩種常見致病菌的抑制效果均較好，腸膜明串珠菌SNM-5 和NQM-1 的抑菌效果則相對(duì)較差一些。抑菌效果更好的菌株有一定的益生潛能。

圖9 部分菌株的抑菌圈

3 結(jié)論

通過對(duì)乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)初步篩選出8 株凝乳時(shí)間較短的乳酸菌，測定8 株乳酸菌的滴定酸度與持水率，LZM-1、ALM-1、RKZM-5 的后酸化能力較弱，在貯藏14 d 內(nèi)，滴定酸度與持水率的變化率較小。耐受性結(jié)果顯示，可耐受7 % NaCl 濃度、pH4.0 酸性條件、0.1 %膽鹽濃度，并且可在15 ℃與45 ℃環(huán)境中生長，對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌有明顯的抑制效果，所篩選菌株有進(jìn)一步挖掘開發(fā)的潛力。

乳酸菌按照其在乳制品中的作用，可分為發(fā)酵劑乳酸菌和非發(fā)酵劑乳酸菌，發(fā)酵劑乳酸菌多為乳桿菌屬（Lactobacillus）或乳球菌屬（Lactococcus），在牛乳中產(chǎn)酸速率高，可促進(jìn)凝乳。非發(fā)酵劑乳酸菌在奶酪生產(chǎn)過程中產(chǎn)酸作用弱或不產(chǎn)酸，主要起加快奶酪成熟、改善奶酪風(fēng)味的作用[20]。一些嗜溫型乳酸菌如明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus）等在奶酪成熟過程中作為產(chǎn)香菌，可加快成熟并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)奶酪的整體風(fēng)味起修飾作用[21]。以上各種微生物均在西藏曲拉中占有較高的豐度，這些微生物共同發(fā)酵制成曲拉。曲拉作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，自然發(fā)酵的方式賦予了曲拉獨(dú)特的風(fēng)味，同樣有可能使致病菌生長繁殖，導(dǎo)致其安全性受到嚴(yán)重影響。因此，探明發(fā)酵過程中的關(guān)鍵微生物，對(duì)優(yōu)良菌種進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用，對(duì)保證曲拉安全性、改善曲拉風(fēng)味與品質(zhì)等具有重要意義。