包包曲風味萃取方式的對比及GC×GC-TOFMS在其風味化合物鑒定中的應用

陳 荻，楊康卓，劉志鵬，趙 東，2，3，鄭 佳，2，3

（1.宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川宜賓 644000）

“曲乃酒之骨”，曲不僅是白酒釀造所需的糖化劑，同時也是生香劑，對酒的品質和風味形成尤為重要[1]。研究表明，曲的風味影響酒的風味，作為釀造原料的一部分，其所含的大量風味物質及風味前體物質在釀造過程中直接或間接地進入酒體，對中國白酒的香型、風格和流派有著深遠的影響[2，3]。同時，酒曲風味反映其品質，是白酒生產過程中的關鍵控制指標。由此可見，酒曲風味的研究對白酒風味形成機理的探究及實際生產中酒曲質量的控制都具有重要意義。五糧液所用大曲俗稱包包曲，屬于中高溫曲，包包曲的曲香濃郁，發酵力及糖化力強，是五糧液優越香氣的奧秘之一[4]。

全二維氣相色譜飛行時間質譜技術（GC×GCTOFMS）將兩根不同極性的色譜柱連接起來，分析物從一維色譜柱流出后進入二維色譜柱進行二次分離，因此具有靈敏度高、分辨率高、峰容量大等特點，是復雜樣品中風味分析的有效手段[5-7]。GC×GC-TOFMS 在白酒、葡萄酒、啤酒、奶酪、咖啡等食品風味分析領域的應用越來越廣泛[6，8-10]。鄭佳等[2]應用GC×GC-TOFMS 研究了包包曲的蒸餾香氣成分，發現該技術對大曲中含量較低的吡嗪、硫化物等物質具有優越的檢出和鑒定能力，且鑒定化合物的總數遠高于一維GC[11-15]，但相關樣品前處理方法仍有進一步優化的空間。樣品前處理的目的是提取并濃縮其中的風味成分，大曲的風味萃取方法包括液液萃取（LLE）、頂空固相微萃取（HS-SPME）、溶劑輔助蒸發萃取（SAFE）、攪拌棒吸附萃取、索氏提取等，其中HS-SPME 的應用最為普遍[16]，目前尚未有針對這些方法的對比研究。

因此，本研究的目的是對比LLE、HS-SPME、SAFE 等方法在包包曲風味成分萃取中的效果，并利用GC×GC-TOFMS 建立針對包包曲風味的有效分析方法，對科學認識包包曲中曲香的組成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗材料

生產用曲粉，采自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車間。

1.1.2 試劑及耗材

二氯甲烷、乙醚均為HPLC 級，購自百靈威公司；正戊烷，分析純，購自成都科龍化工廠；無水硫酸鈉、無水氯化鈣均為ACS 級，購自阿拉丁公司；氯化鈉，GR 級，購自阿拉丁公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，購自美國Supelco公司。

1.1.3 儀器設備

全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀由Agilent 7890B 氣相色譜（Agilent Technologist，美國）、Pegasus 4D 飛行時間質譜儀（LECO，gouzi 美國）和多功能自動進樣器（Gerstel，ML2，德國）組成；調制器（LECO，美國）為液氮型調制器；全二維氣相色譜由一維氣相色譜柱箱和安裝在其內的獨立控溫的二維色譜柱箱構成。一維色譜柱為極性柱DB-WAXext（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W，美國），二維色譜柱為中等極性柱Rxi-17Sil MS（2.0 m×0.1 mm×0.1 μm，Restek，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 香氣成分提取

1.2.1.1 HS-SPME方法

HS-SPME 分為濕法[12]和干法[17]，濕法HSSPME 向15 mL 頂空瓶添加5 mL 飽和食鹽水和2 g曲粉，干法HS-SPME 只添加2 g 曲粉，水浴50 ℃平衡10 min，采用經過老化的萃取頭吸附30 min，最后在進樣口230 ℃下解吸附5 min。

1.2.1.2 LLE方法

稱取20 g 曲粉于燒杯中，加入0.2 g 氯化鈣及50 mL 去離子水，用封口膜封口，冰浴超聲過夜，冷凍離心取上清液，加入等體積乙醚戊烷混合液（1∶1）萃取3 次，冷凍離心破乳，合并上層萃取相，加入0.5 g 無水硫酸鈉除去多余水分，氮吹濃縮至500 μL[18]。

1.2.1.3 SAFE方法

稱取20 g 曲粉于50 mL 藍蓋瓶中，加入20 mL二氯甲烷萃取3 次，離心后合并萃取液，在50 ℃，1×10-3pa 條件下進行SAFE 處理以除去多余油脂和色素，收集萃取液，氮吹濃縮至500 μL[19]。

1.2.2 GC×GC-TOFMS條件

GC 條件：進樣口溫度230 ℃，一維柱箱起始溫度45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min。GC 二維柱箱全程保持比一維柱箱高5 ℃。調制補償溫度20 ℃。調制周期為4 s（熱脈沖時間0.8 s）。色譜柱采用恒流模式，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min。進樣口為不分流進樣方式，進樣量為1 μL。

TOFMS 條件：GC 連接線溫度240 ℃，電離電壓-70 eV，離子源溫度230 ℃，檢測器電壓1500 V，質量數范圍35～400 amu，數據采集頻率100 spectra/s。

1.3 數據處理

參考文獻所述方法[20]，采用ChromaTOF軟件進行自動解卷積和譜庫（mainlib,standards,NIST 和replib）比對，選擇相似度大于800、信噪比大于50的組分，比較實驗分析中和文獻中的保留指數，結合香氣成分標準物質的保留時間進行物質的綜合鑒定。根據各化合物峰面積占比計算其相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 二維總離子流圖

包包曲的風味萃取除了注重風味成分的萃取效率之外，還需要考慮色素及油脂的去除，因此，研究采用了LLE、HS-SPME、SAFE 等多種萃取方法對包包曲中的風味成分進行萃取。HS-SPME 由于沒有溶劑萃取的過程，因此不存在油脂和色素的干擾，LLE 和SAFE 的萃取結果顯示，SAFE 能完全去除樣品中的油脂和色素，LLE 的濃縮樣品則呈極輕微的透明的黃色，樣品中殘留了一定色素。

圖1 為包包曲的風味成分二維總離子流圖。由圖1 可知，經過多種前處理方法提取結合GC×GC-TOFMS 分析后，檢出大量揮發性組分，證明包包曲的風味組成十分復雜。圖中LLE 萃取所得的風味物質種類及含量明顯高于其他方法。對二維總離子流圖采用Pegasus 4D 飛行時間質譜儀自帶工作站軟件ChromaTOF 對照NIST 質譜庫檢索解析，再結合標品質譜和保留時間、文獻保留指數等綜合對比，得到所有化合物的鑒定結果。數據顯示LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HS-SPME-DRY 樣品中鑒定出的物質分別為316 種、172 種、176 種、217 種，均遠遠超過大曲樣品一維GC-MS 的鑒定數量[11-15]。LLE 和SAFE 的萃取效果都受萃取劑影響，兩者萃取劑并不相同，除此之外，SAFE 蒸餾過程中容易損失難揮發物質；兩種HS-SPME 方法則受到樣品量及萃取頭吸附性的限制。

圖1 包包曲風味物質的二維總離子流圖

2.2 風味化合物數量

不同萃取方法對不同種類化合物的萃取效率不同，因此，為了分析不同萃取方式的特點，對四組樣品中的化合物進行了歸類，圖2 為不同樣品中化合物的分布。結果顯示，醇類是所有樣品中數量最多的化合物（“其他”包含化合物種類較多），醇類在數量上的優勢在以往關于包包曲[2，11]乃至酒曲[13]的研究中均有報道。就萃取方法而言，LLE 萃取樣品中，除了酯類，其他種類化合物都比其他方法豐富，體現了其在整體萃取效率上的優勢，推測原因為相較于SAFE，LLE 萃取過程簡單，損失更少，相較于HS-SPME，LLE 會檢測到更多難揮發的物質。SAFE 除色素和油脂的效果最佳，但在萃取化合物的豐富程度上不具優勢。HS-SPME-DRY 的萃取效果優于HS-SPME-WET，具體體現在酯類、醛類和芳香族化合物的數量上，郭兆陽等[21]研究指出，氯化鈉會抑制大曲中組分溶出，這可能是HSSPME-WET 鑒定化合物少于HS-SPME-DRY 的原因。

圖2 包包曲中各類型化合物數量

2.3 風味化合物含量

經統計，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 萃取樣品在二維上的總峰面積分別為44806322、31958804、11364129、24827363，總體萃取效率 LLE＞SAFE＞HS-SPME-DRY＞HSSPME-WET。實驗采用峰面積歸一法定量，圖3 為不同樣品中化合物峰面積占比的統計結果。峰面積的比較，進一步凸顯了醇類在包包曲風味成分中的優勢，說明包包曲中的醇類不僅種類多，含量也高。相反，硫化物在各方法中的峰面積占比都較低。除此之外，各個方法呈現出不同的特點，LLE萃取得到的酸類、呋喃和其他類化合物占比明顯高于其他方法。分析認為，酸類普遍沸點較高，因此在損失最少的LLE中得以保留最多，呋喃和其他類化合物則可能因為該方法整體萃取效率高，使數據庫準確鑒定到了更多相關化合物；兩種HS-SPME方法萃取得到的醛類占比都高于其他方法，說明該方法對醛類的吸附性強，其物質分布與已有報道相符[22]。

圖3 包包曲中各類型化合物峰面積占比

2.4 典型風味成分的檢出

由圖2、圖3 可知，各萃取方法對包包曲主要香氣成分醇、酸、酯、醛、酮、芳香族等都有較好的提取能力，因此，吡嗪、硫化物等低含量物質的檢出效果成為判斷方法好壞的關鍵。

吡嗪主要由大曲發酵過程氨基酸、蛋白質等發生美拉德反應產生或褐變反應產生，除此之外，也可以由微生物在曲藥中迅速繁殖并代謝產生[23]。吡嗪類化合物是一類對白酒風味形成有重要貢獻的微量化合物，也是白酒中重要的功能性成分[24]，這類物質主要呈現巧克力、堅果、花生味等香氣，被認為是大曲中焦香味、烘焙味的主要來源[1]，各方法檢出吡嗪的數量分別為LLE 13 種，SAFE 5 種，HSSPME-WET 11 種，HS-SPME-DRY 11 種，可見LLE 具有優勢。LLE 檢出的典型吡嗪物質包括吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，均為大曲中典型的吡嗪類化合物[2，11，19，25]。

表1 包包曲中的吡嗪化合物

表2 包包曲中的硫化物

硫化物在白酒或大曲中的含量都比較低，硫化物的閾值極低，具有強烈的洋蔥、大蒜、臭雞蛋或者爛白菜味道，硫化物在濃度較低的情況下，對白酒的風味起著有利作用[26]。各方法檢出的硫化物數量 分別為LLE 4 種，HS-SPME-WET 2 種，HSSPME-DRY、SAFE 均為1 種，可見，LLE 在硫化物檢測方面也具有優勢。

就單個化合物討論，2,3-丁二醇在所有方法中峰面積占比都大于1%，尤其在LLE 和SAFE 中，占比分別達到了15.80%和36.86%，楊理章等[15]在采用LLE 萃取高溫大曲中的風味物質研究中也指出了這一現象。同時，苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁內酯的占比也在不止一種方法中超過了1%，這與前人關于包包曲風味的研究結論相符[2，11]。此外，正己醇和2-戊醇只在兩種HS-SPME 方法中含量超過1%，這可能與方法的選擇性有關。

3 結論

本研究采用GC×GC-TOFMS 技術檢測包包曲中的香氣成分，多方面對比了LLE、SAFE、HSSPME 等多種方法在包包曲風味萃取中的效果。結果顯示，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 樣品中鑒定出的物質分別為316 種、172 種、176 種、217 種。LLE 在化合物總峰面積、化合物數量、低含量物質的檢出方面都具有優勢，但樣品中殘留一定色素。SAFE能完全去除油脂和色素，但在蒸餾過程中可能存在風味成分的損失。干法HS-SPME對包包曲風味成分的萃取效果優于濕法HS-SPME，兩者對比其他方法對醛類表現出更好的吸附性。此外，醇類在包包曲中數量最多，含量最高；就單個化合物而言，2,3-丁二醇、苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁內酯等在包包曲中相對含量較高。本研究可為包包曲乃至酒曲的風味研究提供數據基礎及方法參考。