益氣養陰方對糖尿病性腦內微小病變實驗大鼠的保護作用*

趙雅潔，劉笑迎，曹 賀，游 毅

（1.上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院，上海 200080；2.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院，上海 200011；3.上海市楊浦區中醫醫院，上海 200090）

糖尿病性腦內微小病變，是由長期糖尿病導致的并發癥，病人主要病因為“消渴”，主要病機為本虛標實，本虛在于氣陰不足，陰精虧損，標實在于瘀血阻滯。而糖尿病性腦內微小病變的發展變化，也符合絡病的傳變特點，具有時間性，局部性與廣泛性，功能失常為主導，難治性和纏綿性，進展性，復發性。提示治療糖尿病性腦內微小病變應當持之以恒，緩以圖之。因此，雖然腦內微小病變尚無腦卒中先兆的表現，我們在原理上也可以將其視為“中風先兆”的一種無表現型，治療上可以參照“中風先兆”。本實驗以此為依據，對糖尿病性腦內微小病變模型大鼠進行治療并評估治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗動物及試劑

健康雄性1月齡Wistar 大鼠，由上海中醫藥大學試驗動物中心提供，體質量80～90 g。

1.1.2 實驗造模

參照趙寶珍等改良的2 型糖尿病模型建立方法，具體見參考文獻[1]。

1.1.3 實驗分組與藥物制備

各組動物隨機分為正常對照組（normal control，NC 組）；高糖損傷組（diabetes mellitus，DM 組）；阿司匹林對照組（aspirin control，AC 組）；中藥組（traditional Chinese medicine，TCM 組），6 只/組。

中藥組：養陰益氣方（黃芪、丹參、山藥、知母、黃柏、白芍）各10 g，加10 倍水煎煮1 h，過濾，藥渣加5倍水煎煮1 h，過濾，合并濾液，水浴濃縮至2 g 生藥/mL 藥液。

阿司匹林組：阿司匹林腸溶片，拜耳制藥，大鼠灌胃給藥體積為1 mL/kg。

1.1.4 實驗方法

NC 組、DM 組造模完成后分別以生理鹽水灌腸；AC 組，TCM 組造模完成后分別以阿司匹林片及中藥灌腸。4 組大鼠均在灌腸開始后第6月處死取材。

1.1.5 檢測指標

（1）生化檢測

每組大鼠按月抽取血液進行糖化血紅蛋白檢測。

（2）分子生物學檢測

標本處理：分別于相應的觀察時間點給大鼠腹腔注射10%水合氯醛，過量麻醉后后處死，在無菌條件下切取大鼠腦組織，投入多聚甲醛中固定后用石蠟包埋。迅速放入液氮，繼而轉至-70℃冰箱凍存。

標本檢測：各組均以流式細胞術觀察細胞凋亡情況；RT-PCR 熒光定量檢測大鼠腦內組織HIF-1α mRNA 的表達；Western blot 及免疫組化方法檢測HIF-1α 蛋白表達。

A.凋亡率測定：使用流式細胞儀檢測。試驗重復3 次。

B.HIF-1α mRNA 表達：采用Realtime PCR 方法測定。引物序列為：

HIF-1α mRNA

Primer F 5′-ACTATGTCGCTTTCTTGG-3′

Primer R 5′-TTTCTGCTGCCTTGTATG-3′

Size：194 bps

Gapdh mRNA

Primer F 5′-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3′

Primer R 5′-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3′

Size：237 bps

按說明書用Trizol 提取總RNA，制作HIF-1α/GAPDH 的標準曲線，并進行Realtime PCR 反應試驗重復3 次。

C． HIF-1α 蛋白的表達：采用Western blot 測定，用Lowry 法測定所收集的蛋白質含量，以GAPDH 作內參。4 ℃孵育過夜后，以TBS-T 洗膜3 次，加入有辣根過氧化物酶標記的二抗（羊抗兔IgG-HRP）室溫孵育1 h，以TBS-T 洗膜3 次，ECL 顯色。膜經凝膠成像儀（Bio-rad）記錄相應的表達量。實驗重復3 次。

1.2 統計分析

所得數據均用SPSS 20.0 軟件進行統計處理。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布者，各組間均數差異用方差分析，雙側檢驗，P＜0.05認為有統計學差異；非正態分布者，用秩和檢驗，P＜0.05 認為有統計學差異。

2 結果

2.1 生化檢測 與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組每10 g 血紅蛋白吸光度表達量都有所減少，且各組之間相比有明顯統計學差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組糖化血紅蛋白吸光度表達量有所增加（P＜0.05）。見表1。

表1 糖化血紅蛋白吸光度的組間比較（±s）

表1 糖化血紅蛋白吸光度的組間比較（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n糖化血紅蛋白吸光度正常對照組61.26±0.17高糖損傷組65.35±0.19▲阿司匹林組62.63±0.10▲△中藥組63.48±0.22▲△*

2.2 細胞凋亡率檢測 由早期凋亡率結果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組凋亡量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組凋亡都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統計學差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組凋亡率所增加，但無明顯統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 大鼠腦神經細胞凋亡率測定

表2 大鼠腦神經細胞早期凋亡率測定（±s）

表2 大鼠腦神經細胞早期凋亡率測定（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n早期凋亡率正常對照組63.80±0.36高糖損傷組625.13±2.22▲阿司匹林組617.00±1.90▲△中藥組620.50±1.02▲△*

由晚期凋亡率結果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組凋亡量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組凋亡都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統計學差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組凋亡率所增加（P＜0.05），說明該中藥對晚期凋亡抑制較早期差。見表3、圖1。

表3 大鼠腦神經細胞晚期凋亡率測定（±s）

表3 大鼠腦神經細胞晚期凋亡率測定（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n晚期凋亡率正常對照組60.80±0.36高糖損傷組69.90±1.10▲阿司匹林組63.40±0.53▲△中藥組66.30±1.05▲△*

2.3 HIF-1αmRNA 表達 由Realtime PCR 結果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組HIF-1αmRNA 表達量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組、HIF-1αmRNA 表達量都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統計學差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組HIF-1αmRNA 表達量有所增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組HIF-1α mRNA 表達（±s）

表4 各組HIF-1α mRNA 表達（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組△P＜0.05；vs阿司匹林組，*P＜0.05。

組別nmRNA正常對照組60.00268±0.00068高糖損傷組60.04484±0.00203▲阿司匹林組60.01308±0.00021▲△中藥組60.02679±0.00149▲△*

2.4 各組HIF-1α 蛋白表達情況 由Western blot結果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組HIF-1α 蛋白表達量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組、HIF-1α 蛋白表達量都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統計學差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組HIF-1α 蛋白表達量有所增加（P＜0.05）。見表5，圖3。

圖3 各組HIF-1α 蛋白表達

表5 各組HIF-1α 蛋白表達（±s）

表5 各組HIF-1α 蛋白表達（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n蛋白正常對照組60.09067±0.04310高糖損傷組60.57133±0.09548▲阿司匹林組60.24667±0.04359▲△中藥組60.43133±0.05897▲△*

3 討論

隨著對腦血管疾病的發生及其危險因素研究的深入，腦卒中一級預防的重要性越來越被人們認識和重視。糖尿病是中風的重要危險因素之一。隨著人們認識的提高，糖尿病的治療和預防達到了一個新的水平。雖然部分患者的血糖在可控范圍內，但還是無法避免中風的發生。近年來，隨著研究的不斷深入，發現糖尿病腦內微小病變可以看作是糖尿病性腦血管病的早期表現[2-4]。

糖尿病是中風和大腦發生微小變化的常見危險因素之一。預防大腦中的微小病變可以用“初級預防”指標、“預測因素”[5]。這些認識符合中醫學所倡導的“未病先防，既病防變”的理論。糖尿病腦血管病也是難以治療和預防的疾病之一。糖尿病合并微小腦病變的西醫治療效果不佳，中醫治療的具體機制尚不明確；中藥和方劑的選擇也是有爭議的[6]。

腦內＜3 mm 的微小病變使其患腦梗死及腦梗死相關死亡的風險增加至少3 倍。Knopman 教授[7]統計的1 906 名志愿者中，從足夠的腦MRI 資料中發現，腦白質的微小梗死是腦血管事件隱匿進展的重要原因。可見，治療腦內微小病變是否可以作為腦卒中的“一級預防”手段已成為人們關注的熱點話題，而糖尿病是腦卒中與腦內微小病變的共同危險因素，糖尿病性腦血管病也是難治難防的疾病之一。對于糖尿病患者來說，通過預防糖尿病性腦內微小病變，進一步預防腦卒中，是十分必要而可行的。基于這一現狀，充分發揮中醫藥的優勢和特點，結合中醫藥“絡病論”“扭轉論”等理論，提出并實施了“養陰截斷療法”等理論[8-9]。我們的實驗采用益氣養陰法治療糖尿病性腦內微小病變取得一定療效。

缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是迄今為止發現的唯一能在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子，對細胞缺氧起穩定作用，是缺氧或某些氧化應激狀態下產生的誘導低氧基因和修復細胞內環境的調節因子，是依賴氧濃度調節的主要因子，對周圍氧環境具有較強敏感性[10-13]。其在哺乳動物和人體廣泛存在，直接或間接調節著血管生成、細胞增殖與凋亡、能量調節等眾多通路[14]。國內外有諸多學者用不同的方法不同的動物證明[7]缺氧時HIF-1α 表達增高。

腦內微小病變中醫并沒有明確記載，但根據其表現，MRI-T2WI 的主要病理變化為游離水（H+）和亞急性血腫[15]，可歸于中醫的“有形之邪”范疇。中醫一般將有形之邪歸結為血瘀、痰濕等病理產物，所以微小病變可以理解為痰濕、血瘀等阻滯腦絡，產生小“癥”“癥瘕”。“無癥狀、無征兆”——“中風”的“癥狀”雖然沒有出現，但在“病”中，借助現代醫學手段，已經可以看出實實在在的弊端。它符合現代中醫的“絡病論”[16]理論。

益氣養陰方由黃芪、丹參、山藥、知母、黃柏、白芍組成，采用益氣養陰來治療糖尿病性腦內微小病變。追溯治療“中風病”理論源流，有關陰精虧虛與中風先兆的關系，明代張景岳在《景岳全書·非風》中曾指出：“……多以素不能慎，或七情內傷，或酒色過度，先傷五臟之真陰。”其病機為“陰虧于前，而陽損于后；陰陷于下，而陽泛于上，以致陰陽相失，精氣不交，所以忽而昏饋，卒然仆倒……”此后，葉天士承前啟后進一步闡明了腎精虧虛、收納無權是中風先兆致病因素之一，他說：“腎陰弱，收納無權，肝陽熾，虛風蒙竅。”又說：“精血衰耗，水不涵木，木少滋榮，故肝陽偏亢。”進一步導致“內風旋動”，其表現為上實（脈弦動、眩暈、耳聾）、下虛（下肢無力）等腎虛欲仆之癥。針對這一病理特點，葉天士采用填補真陰法來截斷中風的發生，既可補其不足，又可截斷病變之發展，療效顯著。葉天士在《臨證指南醫案·中風》32 案中有關中風先兆的醫案就有5 案。這是葉天士繼《內經》《難經》《傷寒論》之后，運用中醫“治未病”這一最高治療原則，采用“養陰截斷療法”，論治中風先兆的獨特經驗，實踐證明，葉天士對中風先兆的防治經驗至今對預防中風仍有較高的實用價值。這又正好與我們研究的糖尿病性腦內微小病變，糖尿病體質的病人陰精多不足的理論吻合。

本方中黃芪味甘，性微溫，針對糖尿病并發癥的“虛”證病機，具有益氣養元，扶正祛邪，補氣升陽、通經脈的功效。臨床及藥理研究表明，黃芪具有調節內皮細胞一氧化氮水平，調節血管生長因子VEGF 表達，降糖及抗脂質過氧化的作用。丹參味微苦，性微寒，針對糖尿病并發癥，具有活血化瘀，通利經絡的作用。現代研究表明，它具有調節細胞VEGF 表達，抗內皮細胞細胞凋亡的作用，此外還具有一定降血糖作用。山藥味甘，性平，具有益氣養陰，治本的作用。現代藥理研究也表明山藥具有滋補、降血糖等重要作用。我們先期臨床和動物實驗研究發現以黃芪、山藥、丹參為君藥的方劑能改善糖尿病的周圍神經癥狀；體外實驗也發現黃芪、丹參[9]對內皮細胞[17-18]損傷有保護作用；地龍性寒，味咸，具有溶解血栓、激活纖溶酶原、抑制血小板聚集、降低血脂等作用[19]。許多臨床研究結果也表明地龍治療腦卒中有效。我們利用其消癥通絡的作用機理，將其[20-22]應用于腦內微小病變并取得了良好的療效。

本實驗提示益氣養陰方對糖尿病性腦內微小病變的治療具有一定的作用，可降低糖化血紅蛋白吸光度，降低腦神經細胞凋亡率，此外我們還發現，本方可降低HIF-1α 的表達。HIF-1α 是缺氧或某些氧化應激狀態下產生的誘導低氧基因和修復細胞內環境的調節因子[23]。HIF-lα 在腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）的破壞過程中起重要作用，缺血缺氧后，可見BMECs 腫脹，空泡形成，部分細胞線粒體腫脹或空泡化，自噬體增多，核糖體脫落，甚至細胞核染色質固縮，最終導致血腦屏障破壞[24]。

綜上所述，我們認為糖尿病性腦內微小病變治療宜從“虛”“實”兩方面入手，扶正祛邪，采用“養陰益氣法”。