恩度抑制大鼠肝纖維化與肝癌的機制研究

楊國威，杜瑩瑩，程序，譚莉霞，王航宇，董勇，仝甲釗，武利萍

河南大學第一附屬醫院消化內科，河南 開封 475001

肝癌為導致全球患者死亡第二大癌癥，我國肝癌發病率、中標率及世標率分別為24.09/10 萬、12.73/10 萬、13.89/10 萬，由其所致疾病與經濟負擔逐漸成為重要公共衛生問題[1]。研究顯示超過80%肝癌患者病情進展經歷了慢性肝炎、肝纖維化、肝癌這一逐步進展過程[2]。研究者們近期嘗試從分子層面解釋肝纖維化-肝癌發生具體機制，以便通過靶向特定分子延緩甚至阻斷肝臟疾病進展[3]。轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)為促進肝纖維化獨有因子，其涉及TGF-β/Smad 信號通路介導了肝纖維化-肝癌過程[4]。恩度可以經由抑制TGF-β表達而減輕TGF-β誘導纖維化作用，進而發揮明顯抗纖維化作用[5]?；诖耍狙芯刻骄慷鞫葘Υ笫蟆案卫w維化-肝癌”抑制作用及具體作用機制，為后期肝癌抗腫瘤治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠90 只，體質量180~200 g，在醫院動物房以標準飼料分籠飼養，飼養溫度20℃~25℃，可以自由進食飲水，光照與黑暗時間均為12 h。

1.2 儀器與試劑 JA1003 型號天平購自上海精科儀器有限公司，光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，Multiskan MK3 型號酶標儀購自Thermo Labsystems 公司，LEICARM2035 型號生物組織石蠟切片機購自湖北孝感市亞光醫用電子技術有限公司，BM-Ⅱ型號包埋機購自安徽電子科學研究院，IQTM5 型號實時熒光逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR)購自美國Bio-Rad 公司，DYY-8B 型電泳儀購自北京六一儀器廠，Tanon 型號凝膠成像分析儀購自上海天能科技有限公司；DEN 購自美國Sigma 公司，恩度購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)素購自BASO 生物科技有限公司，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白 蛋 白(albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，TBI)酶聯免疫吸附試劑盒均購自四川邁克生物科技股份有限公司，羥脯氨酸及堿性磷酸酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Trizol 試劑盒、High-capacity cDNA reverse transcription kits均購自美國Gene Copoeia公司，蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid assay，BCA)試劑盒均購自金克隆(北京)生物技術有限公司，兔TGF-β1、轉化生長因子-β受體Ⅰ(transforming growth factor-β recipient Ⅰ，TβRⅠ)、轉化生長因子-β受體Ⅱ(TβRⅡ)、Smad2/3 均購自美國Cell Signaling Technology 公司，小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，辣根過氧化酶標記山羊抗兔、抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，發光液購自北京伊塔生物科技有限公司。

1.3 大鼠模型構建及分組 90 只小鼠在動物房適應性飼養1周，將所有小鼠隨機分為正常組、模型組、恩度組，每組30只。模型組以10 mg/kg濃度腹腔注射0.2%DEN，每周5次，連續注射16周，對照組以9 g/L濃度注射等量注射生理鹽水，于8 周、12 周、16周分別處死5只進行病理檢測，以明確預期病理分型。確定病理分型后恩度組于尾靜脈以20 mg/(kg·d)劑量注射恩度，此時對照組與模型組注射等量9 g/L濃度生理鹽水，繼續注射，飼養至20周處死小鼠。小鼠處死前收集心臟血測定肝功能指標及纖維化指標，處死后獲得肝臟組織行病理檢測與相關信號通路mRNA及蛋白測定。

1.4 肝組織大體形態觀察 觀察8 周、12 周、16周及20周處死大鼠完整肝臟組織，統計肝表面結節數量，將大鼠肝組織腫瘤剝離，稱重肝組織腫瘤，統計瘤重、肝臟指數、抑瘤率，肝臟指數=肝臟組織重量/總重量×100%，抑瘤率=(模型組瘤重-恩度組瘤重)/模型組瘤重×100%。

1.5 肝組織病理檢測 恩度注射4 周后將大鼠處死后收集肝組織應用4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、HE染色、脫水、封片等處理，隨后置于光學顯微鏡下觀察拍片，并行肝纖維化分級[6]評估，0 級為組織中無纖維化，1 級為肝小葉中有纖維瘢痕或者肝竇附近及匯管區出現纖維化，2 級為大部分肝小葉結構完整，但是可以觀察到纖維存在間隔，3級為肝小葉可以觀察到紊亂，纖維間間隔較多，但是未達到硬化標準，4級為肝實質損傷，出現纖維彌漫性增生，可見假小葉，且肝組織顯示為肝硬化前期，0 級、1 級、2級、3級與4級分別計分0分、1分、2分、3分、4分。

1.6 肝功能指標及纖維化指標測定 最后一次給藥結束后第2天，以50 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉處理大鼠收集心臟血500 μL，離心后獲得血清，采用酶聯免疫吸附試劑盒測定ALT、AST、ALB、TBI等肝功能指標。采用比色法測定羥脯氨酸及堿性磷酸酶等纖維化指標水平。

1.7 肝 組 織 中TGF-β/T β R/Smad2/3 信 號 通 路mRNA水平測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ)、TβRⅡ、Smad2/3 mRNA 水平采用RT-PCR 測定。肝臟組織100 mg 勻漿處理后采用Trizol 試劑盒進行總RNA 抽提，抽提后采用DEPC 水溶解后在紫外分光光度計上進行總RNA 濃度測定。依據High-capacity cDNA reverse transcription kits進行mRNA反轉錄。在RT-PCR儀上進行RT-PCR 擴增，反應條件設置為：在95℃、95℃、60℃分別處理30 s、5 s、34 s，一共需要循環40次，引物序列見表1。內參選擇GAPDH，最終結果采用2-ΔΔCt計算。

表1 各引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 肝組織中相關信號通路蛋白表達測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 蛋白水平采用蛋白印跡法進行測定。小鼠肝臟組織剪碎后置于蛋白裂解液中獲得總蛋白，采用BCA試劑盒確定提取蛋白濃度，置于沸水浴中加熱10 min，電泳后進行轉膜處理，蛋白應用5%脫脂牛奶置于室溫下封閉處理1 h，加入一抗后置于4℃過夜處理，第2天應用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，隨后添加對應二抗，室溫環境孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次添加發光液予以顯色，GAPDH 為內參。凝膠成像系統拍照后采用Image J軟件進行分析。

1.9 統計學方法 應用SPSS20.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠肝臟組織病理學染色情況比較 HE染色可見正常組織內部肝細胞規律整齊排列，肝葉結構完整(圖1A)；模型組可以肝組織結構異常，存在大量無序假小葉結構，小葉內部可以明顯觀察到纖維化和局灶性細胞壞死，其中存在大量炎癥細胞浸潤，可見異型細胞，細胞的細胞核呈不規則狀(非典型性癌灶)，肝小葉結構出現不同情況損傷(圖1B)；恩度組雖然依然可見肝細胞損傷及炎癥細胞浸潤，但是損傷較模型組輕，肝纖維化程度低，假小葉形成不明顯(圖1C)。

圖1 HE染色(40×)Figure 1 HE staining(40×)

2.2 三組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數及腫瘤情況比較 恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數、結節數、瘤重明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而恩度組與模型組大鼠肝臟指數均高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組t/F值P值只數抑瘤率(%)5 5 5肝臟纖維化分級-4.00±0.71 2.60±0.55b 3.486 0.008肝臟指數(%)1.56±0.29 5.19±0.72a 3.97±0.51ab 59.336 0.001結節數(個)-10.82±2.67 7.43±1.82b 2.346 0.047瘤重(g)-2.95±0.33 1.52±0.39b 6.259 0.001--18.26±3.86--

2.3 三組大鼠的肝功能比較 模型組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯高于正常組，ALB 水平明顯低于正常組，而恩度組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯低于模型組，ALB 水平明顯高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值只數5 5 5 ALT(U/L)36.52±4.01 88.56±9.87a 64.85±7.12b 62.015 0.001 AST(U/L)58.63±6.25 176.21±18.60a 109.58±11.36b 101.447 0.001 TBI(μmmol/g)4.36±0.58 11.14±1.26a 7.59±1.39b 44.737 0.001 ALB(g/L)44.85±4.85 22.74±2.39a 38.52±4.06b 42.539 0.001

2.4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較 模型組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯高于正常組，恩度組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值堿性磷酸酶(kU/L)2.65±0.39 6.76±0.68a 5.32±0.61b 66.123 0.001只數5 5 5羥脯氨酸(μg/g)2.41±0.32 6.85±0.74a 4.26±0.51b 81.981 0.001

2.5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3信號通路mRNA 水平比較 模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 等mRNA 水平明顯高于正常組，而恩度組大鼠的TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3等mRNA水平均明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值0.94±0.13 2.24±0.34a 1.76±0.18b 41.025 0.001 5 5 5 1.72±0.22 3.36±0.42a 2.32±0.31b 32.184 0.001 0.95±0.12 2.86±0.47a 1.74±0.19b 50.908 0.001 0.91±0.10 2.92±0.36a 1.71±0.20b 85.526 0.001 Smad2/3只數TGF-β(ng/mL)TβRⅠTβRⅡ

3 討論

DEN 所致肝癌模型與人體肝癌發生進展過程相似，為探究肝癌發生進展機制及篩選肝癌治療潛在藥物[7]，本研究選擇DEN 誘導肝癌大鼠模型作為研究對象。在應用DEN處理后，模型組大鼠可見肝臟組織表面逐漸粗糙，可見結節存在，結節數量隨著飼養時間延長而變多，結節大小不一，顯示大鼠肝組織出現癌變變化。HE 染色可見，模型組大鼠肝臟組織結構中存在大量無序假小葉結構，其內浸潤有大量炎癥細胞，伴有大量異型癌灶細胞，這些細胞細胞核形狀不規則，顯示DEN誘導肝癌模型成功。

恩度作為血管內皮抑制劑，已被應用于多種腫瘤治療中，目前研究證實其可以經由阻斷血管內皮生長因子受體磷酸化過程，將新生血管形成信號傳導過程阻斷，進而發揮明顯抗腫瘤作用[8-9]。本研究中恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數、結節數、瘤重均低于模型組，恩度組大鼠抑瘤率為(18.26±3.86)%，顯示重組人血管內皮抑制素恩度確實可以發揮抑制腫瘤生長作用。吳占慶等[10]研究顯示中晚期原發性肝癌采用重組人血管內皮抑制素治療可以經由抑制新生血管形成，阻斷病灶營養，發揮顯著抗腫瘤作用。研究顯示肝細胞癌進展過程包括慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化等諸多過程，其中羥脯氨酸作為形成膠原重要氨基酸，堿性磷酸酶在肝細胞損傷或者癌變情況下釋放異常增多[11]。本研究中肝癌大鼠應用恩度處理后，羥脯氨酸、堿性磷酸酶等纖維化指標水平下降，顯示恩度有效抑制肝癌大鼠肝纖維化進程，既往研究中恩度經由抑制新生血管生成發揮抗腫瘤作用[12]，本研究中恩度可能通過減輕肝癌大鼠肝臟損傷及纖維化程度發揮顯著抗腫瘤作用。

為明確恩度對肝癌大鼠抗纖維化-抗腫瘤具體作用機制，本研究測定了大鼠TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA 及相關蛋白水平。本研究中模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ等mRNA水平均顯著高于正常組，分析認為TGF-β可以促進肝星狀細胞活化，促進膠原蛋白分泌，抑制膠原蛋白水解酶活性，使細胞外基質降解及合成平衡被打破，并在組織間隙沉積，導致肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，進而使肝臟出現纖維化病變[13]。恩度處理則會抑制肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ基因水平，TβRⅠ、TβRⅡ為TGF-β受體，為激活下游Smad 信號重要條件[14]，推測恩度抗纖維化-抗腫瘤作用可能與抑制TGF-β及其受體表達有關。TGF-β/Smad 信號通路發揮作用過程主要為：TGF-β與TβRⅡ結合，隨后募集并活化TβRⅠ，TβRⅠ使Smad2/3激活，形成磷酸化Smad2/3，其后與Smad4構成異源三聚體復合物，復合物入核后可以發揮調節目的基因表達情況，胞漿內部Samd7 入核后則會促進復合物解離而中止上述反應[15-17]，因此，推斷恩度下調肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表達，進而抑制下游Smad2/3信號通路信號傳導。另有研究顯示α-亞麻酸植物甾醇酯有助于改善小鼠肝纖維化，這一作用與α-亞麻酸植物甾醇酯下調TGF-β1表達并抑制下游靶分子Smad蛋白表達關系密切[18]，與本研究中相關結論類似。Yang等[19]研究也顯示在肝臟疾病的發生過程中，TGF-β信號轉導介質Smads受到結構域特異性位點磷酸化的嚴格控制，Smad3 磷酸亞型pSmad3L 和pSmad3C 是可逆的和拮抗的；pSmad2L/C 可通過刺激細胞外基質合成，與pSmad3L 共同作用，介導肝組織纖維化過程，與本研究中相關結論一致。

綜上所述，恩度可以明顯抑制DEN誘導大鼠肝纖維化-肝癌過程，其作用機制可能與抑制TGF-β及相應受體表達、調控下游Samd2/3 信號激活有關。本研究雖然證實恩度可以發揮明顯抗纖維化-肝癌作用，但是并未明確采用何種濃度恩度處理才可發揮最佳抗纖維化-肝癌效果，這將是下一步研究關注重點。