‘甜蜜藍寶石’葡萄組培技術研究

周 閏，楊 亞，駱夏輝，劉躍榮，彭丁文，劉 偉，申超峰，徐 嚴

（郴州市農業科學研究所/湖南省農業科學院郴州分院，湖南郴州 423000）

葡萄作為重要的經濟類果樹作物之一，具有悠久的栽培歷史和豐富多樣的品種，是世界第二大水果。我國作為葡萄（Vitis viniferaL.）的生產大國之一，葡萄的栽培面積和產量均居世界前列[1]。‘甜蜜藍寶石’是近幾年所研發的一種葡萄新品，別名‘月光之淚’，該品種屬于歐亞種，天然無核，果色藍黑，果肉脆滑，果粒果穗著色均勻一致，果皮輕薄，果肉有淡淡的玫瑰及牛奶香味。果粒為長圓形，最長的超過了5.5 cm，平均粒質量7.7 g，最大的果粒質量在10 g 以上，果穗較大，穗質量2～3 kg，最高產量可達4 000 kg/667 m2。‘甜蜜藍寶石’優質、豐產、耐儲運，且抗病性強于其它歐亞種，近幾年的市場銷量形勢喜人，栽培該品種的果農數量急劇增加[2]，鑒于近年市場對種植藍‘甜蜜藍寶石’葡萄品種的急切需求，快速擴繁該品種有助于獲得較高的經濟效益。

葡萄主要通過扦插和嫁接等無性繁殖方法進行繁殖，雖然該方法具有簡捷方便的特點，但受到區域、季節變化的局限，且容易被病毒感染，最終導致葡萄品種的種性嚴重退化[3-5]。組織培養則能保持親本特性并在短期內大量繁殖，加快市場上優質種苗的推廣速度[6]，同時，莖尖接種還可得到部分脫毒的優質種苗，一直以來，利用組織培養繁育優良品種一直是葡萄苗木生產的研究重點[7]。培養基成分與激素的配比能夠影響外植體的啟動培養和繁殖體的增殖效率，研究表明，添加2 mg/L 6-卞氨基嘌呤（6-BA）和0.2 mg/L 萘乙酸（NAA）的MS 培養基作為‘巨峰’的初代培養基萌芽率達到71.1%，MS 培養基添加0.2 mg/L 3-吲哚丁酸（IBA）、1.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L KT 啟動培養釀酒葡萄莖段外植體，萌芽率達73%以上，圓葉葡萄品種在僅加入6-BA 1 mg/L 的MS 培養基中，莖段增殖效率高,植株生長良好[8-9]。‘甜蜜藍寶石’是一個新品種，其組織培養尚未見報道，建立其組織培養快速繁育體系，對加快其苗木生產和繁育以及提高苗木質量具有重要意義。本試驗以‘甜蜜藍寶石’葡萄當年生半木質化莖段為外植體，對‘甜蜜藍寶石’組培技術條件進行篩選，從而獲得合適的培養體系，為組培進行快速育苗研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

以‘甜蜜藍寶石’葡萄當年生半木質化莖段為試材，取自郴州市農業科學研究所小埠果樹基地葡萄溫室大棚。

1.1.2 試劑

植物生長調節劑：包含6-BA，國藥集團化學試劑有限公司；IBA，上海稼豐園藝用品有限公司；NAA，國藥集團化學試劑有限公司。蔗糖、瓊脂（BR），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基及配制

基本培養基為MS、1/2 MS 及1/4 MS，其中1/2 MS 是將MS 中大量元素成分減半，1/4 MS 是將MS 中大量元素成分減為1/4；所有培養基中均加3%蔗糖和0.65%瓊脂，pH 調節至5.80～5.95，高壓滅菌條件為壓力1.1 kg/cm2，121 ℃保持20 min。

1.2.2 材料消毒

以生長健壯的半木質化莖段為外植體，莖段直徑約為0.8 cm，首先用軟毛刷蘸取洗潔精輕刷莖段表面，然后在流水下沖洗1 h，再剪成長2～3 cm 帶一個腋芽的莖段，置于超凈工作臺上。先用75%酒精消毒40 s，然后用無菌水清洗2 次，再分別用1%、3%次氯酸鈉及0.1%升汞三種試劑消毒，試驗設6 個不同的消毒處理，見表1。

表1 不同消毒處理Table 1 Different disinfection treatment

1.2.3 接種

莖段消毒完后再用無菌水反復漂洗5 次，用滅菌的濾紙吸去表面多余水分。然后切去兩端褐化的傷口，將消毒過的材料切成長1.0 cm 左右帶一個腋芽的莖段，正插于啟動培養基上進行培養。啟動培養基為1/2 MS，不添加任何激素，每瓶接種1 個莖段，每個處理接種20 個莖段，設3 次重復。設置培養室條件如下：保持溫度26 ℃左右，相對濕度為40%～60%，每日光照12 h。15 d 后，統計接種材料的污染率、褐變率和成活率，計算方法分別見公式（1）（2）（3），用以確定最佳的消毒方法。

1.2.4 快繁體系的建立

（1）初代培養

采用篩選出的最佳消毒方法進行消毒，把消毒后的莖段接種于初代培養基上，設置四個配方（分別記作PC1、PC2、PC3、PC4），培養基成分見表2。每瓶接種1 個莖段，每個處理接種30 個莖段，3 次重復。培養條件為保持溫度26 ℃左右，相對濕度為40%～60%，每日光照12 h。30 d 后，記錄生長情況并統計萌芽率。萌芽率按照公式（4）計算得出。

表2 不同初代培養基配方Table 2 Different formulations of primary mediums

式中，A為萌芽的莖段總數，T為接種的莖段總數。

（2）增殖培養

將初代培養腋芽生長最好的培養基作為篩選出的初代培養基配方，接種50 d 后，當該培養基上腋芽生長至株高4～5 cm 時，將其剪下，去掉葉片，從中剪取健康飽滿的處在中間節位的單芽莖段，長度約0.5～1 cm，做到莖段基本一致，然后接種于增殖培養基上，每瓶接種3個莖段，培養基設置5 個配方（分別記作PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5），培養基成分見表3。每個處理接種15 個莖段，設3 次重復，培養條件同初代培養。45 d 后統計萌芽率、平均株高、增殖系數和生長情況。其中增殖系數按照公式（5）計算。

表3 不同增殖培養基配方Table 3 Different formulations of breeding mediums

式中，B為可用于下次繼代的莖段總數，W為接種的莖段總數。

（3）生根培養

增殖培養45 d 后，將腋芽生長最好的培養基作為篩選出的增殖培養基配方，將其中生長的腋芽剪下，去掉葉片，從中剪取健康飽滿的中間節位的單芽莖段，長度0.5～1 cm，做到莖段基本一致，接種于生根培養基，培養基設置5 個配方（分別記作PT1、PT2、PT3、PT4、PT5），培養基成分見表4。每瓶接種5 個莖段，每個處理接種20個莖段，設3 次重復，培養條件與增殖培養條件一致。50 d后觀察生長情況，統計萌芽率、生根率、主根密度及平均根長。其中生根率按照公式（6）計算得出。

表4 不同生根培養基配方Table 4 Different formulations of rooting mediums

式中，C為生根的莖段總數，W為接種的莖段總數。

（4）煉苗和移栽

生根培養50 d 以上，當生根良好的組培苗株高達到5～7 cm、帶5～7 個葉片時，將試管苗置于煉苗室，先擰松瓶蓋煉苗2～3 d，再完全打開瓶口煉苗7～10 d，待莖稈顏色加深，葉片發亮時即可出瓶移栽，將植株小心取出，用自來水洗凈組培苗根部的培養基，準備配制好的基質（含椰糠、草炭土、珍珠巖和蛭石四種成分，比例為2∶1∶1∶1），用多菌靈溶液攪拌至基質土坨不散，分裝至營養缽（直徑約6.5 cm），然后移栽組培苗。將苗子置于育苗箱中，蓋上蓋子保濕，然后保持溫度在25 ℃左右，注意通風，防止基質發霉，當出現新生葉1～2 片時，打開蓋子通風2 d，將苗再次轉入營養袋，觀察成活情況。

1.3 統計分析方法

采用Excel 2007 軟件和SPSS 22.0 軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 外植體最佳消毒方法

用次氯酸鈉消毒后，外植體易出現褐化現象，且影響腋芽的萌發，而用升汞消毒則顏色較正常。由表5 可知，0.1%升汞消毒的表現優于1%、3%次氯酸鈉，莖段外植體的最佳消毒處理是T6，即0.1%升汞消毒15 min，外植體污染率、褐變率和成活率分別是46.7%、13.3%和40.0%。因此，外植體的消毒方法采用先用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min。

表5 外植體最佳消毒方法的篩選Table 5 Selection of the best method for disinfection of explants

2.2 不同初代培養基對莖段誘導的影響

莖段外植體接種到不同初代培養基上，30 d 后統計莖段外植體萌芽率（見表6）。結果表明，外植體在四種培養基配方上都有萌芽，但是在不添加任何激素的1/2 MS上的表現最好，萌芽率達到57.8%，新芽生長正常；以1/2 MS 為基本培養基的另兩個配方，其中添加了6-BA 和IBA 兩種激素，莖段基部產生較多愈傷組織，且新芽生長不正常，后期出現玻璃化現象；在不添加任何激素的MS培養基上，莖段基部膨大明顯，影響腋芽的生長，導致出芽慢且有玻璃化現象。所以確定最佳初代培養基配方為1/2 MS+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂。

表6 不同初代培養基莖段誘導情況Table 6 Stem segment induction in different primary mediums

2.3 不同增殖培養基對莖段培養的影響

增殖培養過程中，5 種培養基上的莖段生長表現各不相同，第45 天統計情況，結果見表7。以不添加任何激素的1/2 MS 增殖效果最好，增殖系數高達5.2，顯著高于其他處理，基本不產生愈傷，生長正常，還能同時生根；在PZ1、PZ2 和PZ3 三種培養基上，莖段基部愈傷率都達到100%，隨著6-BA 濃度的提高，萌芽率逐漸升高，但是愈傷組織越來越大，新芽葉片短小、節間短縮，且部分出現叢生芽及玻璃化的現象；PZ4 中生長激素用NAA 替換IBA，但是其產生的愈傷組織更大，葉片小且偏黃，新芽生長不正常，說明該配方不合適。

表7 不同增殖培養基的培養效果Table 7 Culture effect of different propagation medium

2.4 不同生根培養基對葡萄生根的影響

生根培養50 d 后，隨機選取10 株苗進行統計，結果見表8（見下頁）。‘甜蜜藍寶石’葡萄品種容易生根，不添加任何激素的1/2 MS 培養基生根率也很高，但是新梢莖稈纖細，不利于移栽。添加不同濃度的生長素后均有生根，其中1/4 MS 培養基中添加IBA 濃度為0.1 mg/L 時，即培養基PT1 效果最好，萌芽率達到91.7%，生根率達到88.3%，生長正常，隨著IBA 濃度逐漸提高，雖然新梢莖稈更加粗壯，但基部產生的愈傷更多，導致萌芽率及生根率逐漸降低，新梢生長過慢。而添加0.5 mg/L 的NAA，則出現部分只長根不萌芽的現象，萌芽率只有30%，生根率只有55%，且根為氣生根，愈傷組織大而疏松。

表8 不同生根培養基的培養效果Table 8 Culture effect of different rooting medium

2.5 煉苗移栽情況

試管苗馴化時，保持溫度20～28 ℃，濕度在80%左右，讓試管苗逐漸適應外界的環境，不能操之過急。本試驗采用配制好的基質土用于幼苗的馴化，再次移栽至營養袋時，已經產生較多新根，在營養袋生長兩周后，統計成活率高達90%。

3 討論

外植體消毒作為組織培養的第一步，具有關鍵作用，外植體的生長發育情況及對其消毒時間的長短，對發芽率尤為重要，因此尋求最佳的消毒藥劑及其濃度和時間的組合，控制外植體污染和褐變率，是消毒環節的重要問題[10-11]。本試驗篩選出了較優的消毒方法，但外植體污染率太高，萌芽率過低，可能因為取材于野外的環境，且取材季節過晚，雨季天氣來臨，病菌種類多變且繁殖活躍[12]，導致難以消毒。雖然通過延長消毒時間可以降低部分污染率，但同時也增加了死亡率，最終萌芽率也不高。所以進一步探索合適的取材時間很有必要。

植物激素具有刺激形成層細胞的分裂、誘導愈傷組織、不定芽和不定根的形成等生理作用，缺乏或者過多都會對植物生長產生不利影響[7]。植物組織培養增殖過程中，可以通過腋芽產生不定芽（叢生芽）和腋芽萌發成新梢兩種方式擴繁，生長素類物質在兩種方式中均是必需的，而細胞分裂素類物質在促發叢生芽的方式中是必需的，但在腋芽萌發成新梢的過程中不是必需的[13-15]。但本試驗增殖培養過程，在添加了激素的培養基中，因為基部產生較多愈傷，抑制了發根和抽莖，芽的生長受到抑制，生長緩慢；或者部分產生了叢生芽，但是難以繼續生長，并出現玻璃化現象，所以選擇不添加任何激素的1/2 MS 基本培養基作為增殖培養基，以腋芽萌發成新梢的方式進行擴繁，不產生叢生芽，繼代增殖系數相對較低，但組培苗生長健壯，多次繼代培養后無玻璃化、褐化現象[16-17]；生根培養過程中，隨著添加IBA 濃度的逐步升高，基部產生的愈傷也不斷增多，導致萌芽率及生根率逐漸降低，新梢生長減緩，但是在不添加生長激素的培養基中，新梢莖稈纖細，不利于移栽，所以選擇添加0.1 mg/L的IBA 進行生根培養最合適，這說明一定濃度的外源生長素如IBA、IAA 可促進葡萄根的發育和試管苗生長，但濃度過高誘導產生大量愈傷組織，則會抑制試管苗的生長[18-21]，與大部分研究一致。

營養物質對組培苗的生長狀況影響很大[20]。雖然本試驗中莖段可以一次成苗，一次成苗即將繼代培養和生根培養同時進行，既能加快試管苗的培育速度，又能減少勞動力的消耗，具有很大優勢，但因為采用增殖培養基配方同步生根的苗子莖稈過于纖細，不利于煉苗移栽；而采用生根培養基配方一次成苗，則增殖太慢，因為生根培養后的瓶苗莖稈過于老化，難以再增殖。而用兩次成苗法，即用增殖培養基先增殖，然后再轉接到生根培養基上進行生根培養，則起到了壯苗的作用，能有效提高移栽的成活率，且培養基大量元素的用量減半，在生產上更有成本優勢。所以本試驗增殖和生根分兩步完成，這與大部分研究一次成苗的結論不一致[21]，分析原因可能是培養基的配方需要調整，也可以嘗試縮短生根培養的時間，及時轉接繼代，用以提高增殖率，今后仍需進一步探索。

4 結論

‘甜蜜藍寶石’葡萄的組織培養包括莖段外植體消毒、啟動培養、增殖培養、生根培養以及煉苗移栽環節。本研究發現，‘甜蜜藍寶石’外植體的最佳消毒方法是先采用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min；最佳初代培養基為1/2 MS＋30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂，萌芽率達到57.8%；1/2 MS 增殖培養效果最好，增殖培養45 d，增殖系數高達5.2；生根培養基以1/4 MS+IBA 0.1 mg/L效果最好，生根培養50 d，生根率達到88.3%，新芽莖稈較為粗壯，生長正常；煉苗時，保持溫度20～28 ℃，濕度在80%左右，成活率高達90%。該組培繁殖體系可用于‘甜蜜藍寶石’葡萄新品種的繁育，有一定的潛在應用前景，為其商業化生產提供了理論參考。