推拿對坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型鼠脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白和N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基表達的影響

官乾 劉志鳳 于天源 王厚融 張英琦 徐亞靜 楊震杰 薩出拉 張潤龍 陳金平

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病導致的疼痛,是一種臨床常見、多發(fā)的慢性疼痛[1]。NPP的慢性維持與外周、中樞敏化介導的機械痛、自發(fā)性疼痛導致的中樞突觸可塑性改變相關(guān)。突觸可塑性是指神經(jīng)元突觸在受到損傷刺激時,其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生相應變化的能力。脊髓背角突觸可塑性的改變是參與NPP痛覺傳遞和維持的重要機制[2]。基礎(chǔ)研究證實NPP發(fā)生后,會誘導脊髓背角神經(jīng)元傳遞機械性痛覺超敏反應,導致中樞敏化,表現(xiàn)為突觸可塑性的改變。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及參與突觸可塑性的形成。脊髓背角含有NMDA受體2B亞基(NR2B),其變化會改變突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性,從而影響動物行為。因此NR2B是NPP模型大鼠脊髓背角突觸可塑性變化的重要調(diào)節(jié)因子。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,其活化的標志物是神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。經(jīng)研究證實,星形膠質(zhì)細胞的也在NPP中發(fā)揮重要作用[3]。

前期研究顯示,三法三穴可以改善神經(jīng)損傷大鼠的行為學表現(xiàn),改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠的痛覺敏感程度;三法三穴還能改善大鼠的坐骨神經(jīng)損傷點、脊髓腹角和腓腸肌等超微結(jié)構(gòu),促進周圍神經(jīng)損傷導致的感覺和運動功能恢復,提高突觸傳遞效率,抑制痛覺敏化,促進感覺功能和運動功能的恢復[4-5]。本研究建立坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型,通過機械縮足反射閾值和累積疼痛評分評價機械痛敏反應和自發(fā)性疼痛的恢復情況,通過透射電鏡觀察脊髓背角形態(tài)變化,通過免疫熒光觀察推拿對CCI大鼠脊髓背角GFAP、NR2B表達的影響。探討推拿鎮(zhèn)痛與脊髓背角突觸可塑性變化和星形膠質(zhì)細胞的關(guān)系,為臨床治療NPP提供客觀的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性SD大鼠,45只,體質(zhì)量(200±10)g,購自于斯貝福(北京)生物科技有限公司,飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學動物房內(nèi),3只/籠,環(huán)境溫度(25±1)℃,相對濕度(50±5)%,晝夜節(jié)律,自由飲食,每周更換兩次墊料。適應性飼養(yǎng)1周,經(jīng)電子測痛儀(BIO-EVF5)檢測后篩選出痛閾均一的大鼠36只。所有操作遵循北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定(審批號:BUCM-4-2020111103-4087)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:按摩推拿手法模擬儀(專利號200710187403.1),VonFrey電子測痛儀(BIO-EVF5,生產(chǎn)廠家BIOSEB),超薄切片機(Leica),鉆石切片刀(Daitome),透射電子顯微鏡(hitachi),150目方華膜銅網(wǎng),Olypums顯微鏡。

試劑:電鏡固定液(Servicebio,G1102),無水乙醇(100092183)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司,10000418),812包埋劑(SPI,90529-77-4),鋨酸(Ted Pella Inc),NR2B抗體、羊抗兔二抗AlexaFluor 594、羊抗小鼠AlexaFluor 488(Bioss),GFAP抗體(Elabscience),DAPI染液。

1.3 模型制備

利用隨機數(shù)字表制定隨機分組方案,將36只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、推拿組,每組12只。

結(jié)合預實驗并參照前人所述方法[6-8],制備minor CCI模型模擬臨床NPP,模型組、推拿組大鼠均選取右側(cè)后肢進行造模,并于造模前12小時和造模后12小時禁食、禁水。模型組、推拿組造模:用1%的戊巴比妥鈉(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔麻醉;待充分麻醉后,將大鼠俯臥位固定;于右側(cè)坐骨結(jié)節(jié)下,橫向開口1 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,然后分離并暴露出坐骨神經(jīng),于坐骨神經(jīng)分叉前7 mm,將一根4～0鉻制羊腸線用生理鹽水浸潤后在坐骨神經(jīng)分叉處前端進行結(jié)扎,然后用手術(shù)縫合線逐層縫合皮膚;術(shù)后碘伏棉球再次消毒,在傷口上均勻撒上消炎藥以預防術(shù)后傷口感染。假手術(shù)組造模:僅分離右側(cè)坐骨神經(jīng),不做結(jié)扎,其他步驟同模型組。

1.4 實驗方法

假手術(shù)組與模型組:常規(guī)喂養(yǎng),每日抓握束縛9分鐘,無推拿干預。推拿組:造模后第7天開始干預。用按摩推拿手法模擬儀(專利號:200710187403.1)依次刺激大鼠右側(cè)殷門、陽陵泉、承山穴;依次施行點法、撥法、揉法[7];參數(shù)設(shè)置:力度為4N,頻率為60次/分鐘,每個穴位施術(shù)1分鐘,共9分鐘。治療次數(shù)為20次,每10次休息1次。

1.5 行為學檢測

分別于造模前、干預第0天、干預后第10天、第20天進行測量。每只大鼠測量3次取平均值。

1.5.1 機械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold,PMWT) 采用PMWT評價大鼠痛覺過敏程度。將各組大鼠置于有機玻璃箱中,限定其活動區(qū)域,箱底放置網(wǎng)格鐵絲網(wǎng),待其適應環(huán)境安靜后,用VonFrey電子測痛儀的探頭刺激大鼠右側(cè)足底皮膚,維持5秒左右,每次刺激至少間隔10分鐘,刺激后觀察大鼠反應,當大鼠出現(xiàn)明顯的縮足、舔足動作時,停止操作,此時記錄電子測痛儀數(shù)值,即為PMWT。

1.5.2 累計疼痛評分(cumulated pain score,CPS) 采用CPS評定疼痛強度。將大鼠放于開闊場地評定,后爪不著地,計2分;著地但不負重,計1分;著地并且負重,計0分。若大鼠的后爪被壓迫發(fā)白,表示負重。每5分鐘觀察1次,以術(shù)側(cè)足評分減去對側(cè)足評分即得累積疼痛評分。

1.6 形態(tài)學觀察

干預第20次后取材,取材部位為患側(cè)L4～L6節(jié)段脊髓背角。用1%戊巴比妥鈉(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔麻醉;然后對大鼠進行灌注,灌注后的脊髓用1%鋨酸避光室溫固定2小時;用0.1 M磷酸緩沖液PBS漂洗3次,每次15分鐘;丙酮脫水、滲透;包埋劑包埋,用Leica超薄切片機切片60～80 nm,150目方華膜銅網(wǎng)撈片;鉛染色后,于透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.7 免疫熒光染色

脊髓沉糖脫水后,用OCT包埋劑對脊髓腰膨大組織包埋,切片厚度30 μm,將切片放置于24孔板的山羊血清中封閉,過夜,次日吸去山羊血清,用PBS漂洗三遍,然后加入NR2B一抗和GFAP一抗(1∶200)一抗共同標記星型膠質(zhì)細胞,置于搖床上孵育6小時,用PBST洗3遍;然后加羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗(1∶500),避光,搖床兩小時,洗3遍;DAPI細胞核染色,常溫10分鐘,用PBS漂洗1次,展片,封片,4℃冰箱保存,所制切片于Olypums顯微鏡200倍下觀察并拍照取樣。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學檢測結(jié)果

2.1.1 PMWT結(jié)果 造模7天后,即干預第0天,與假手術(shù)組比較比較,模型組與推拿組大鼠PMWT結(jié)果顯著降低(P<0.01),表明模型制備成功。干預10天后,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠PMWT結(jié)果顯著降低(P<0.01);與模型組相比,推拿組PMWT結(jié)果顯著升高(P<0.01)。干預20天后,與假手術(shù)組比較,模型組PMWT結(jié)果顯著降低(P<0.01);與模型組比較,推拿組PMWT結(jié)果顯著升高(P<0.01),但仍低于假手術(shù)組,且逐漸趨向造模前的閾值,表明推拿可以顯著增加大鼠機械縮足反射閾值,恢復至正常狀態(tài),抑制痛覺敏化。見表1。

表1 各組大鼠機械縮足反射閾值比較

2.1.2 CPS結(jié)果 造模7天后,即干預第0天,與假手術(shù)組比較,模型組和推拿組大鼠CPS顯著升高(P<0.05或P<0.01),說明造模后,大鼠感覺功能受到影響,疼痛強度增加,造模成功;推拿干預10天后,與假手術(shù)組相比,模型組CPS結(jié)果顯著升高(P<0.01);與模型組相比,推拿組CPS顯著降低(P<0.05);推拿干預20天后,與假手術(shù)組相比,模型組CPS結(jié)果顯著升高(P<0.01);與模型組相比,推拿組CPS顯著降低(P<0.01),與干預10天后比較有下降趨勢,但仍高于假手術(shù)組,說明推拿可減輕大鼠疼痛強度,抑制痛覺敏化,促進大鼠感覺功能的恢復。見表2。

表2 各組大鼠累計疼痛評分比較秒)

2.2 形態(tài)學檢測結(jié)果

假手術(shù)組:脊髓背角細胞器基本完整、排列有序,線粒體大小及形態(tài)基本正常,但細胞器數(shù)量相對少,突觸主要為直型突觸。模型組:該突觸為對稱性突觸,超微結(jié)構(gòu)損傷較明顯,膜結(jié)構(gòu)模糊、溶解,基質(zhì)水腫、變淡,微絲、微管稀疏,線粒體(M)大多腫脹,膜局部破損,膜內(nèi)基質(zhì)局部變淡,嵴減少。軸突終末(T)細胞膜不完整,突觸前膜(PM)蛋白聚集,致密區(qū)較短,突觸小泡(SV)數(shù)量較少,個別存在,大多破損。樹突棘(DS)基質(zhì)溶解,大面積水腫區(qū),突觸后膜(PD)致密區(qū)較短、較薄,突觸間隙(SC)尚可。推拿組:該突觸為對稱性突觸,超微結(jié)構(gòu)損傷相對較輕,膜結(jié)構(gòu)完整,基質(zhì)水腫、變淡,微絲、微管稀疏,線粒體(M)輕度腫脹,膜局部破損,嵴存在。軸突終末(T)細胞膜完整,突觸前膜(PM)蛋白聚集,致密區(qū)較長,突觸小泡(SV)數(shù)量較多,少量破損。樹突棘(DS)基質(zhì)溶解,大面積水腫區(qū),突觸后膜(PD)致密區(qū)較長、較薄,突觸間隙(SC)尚可。見圖1。

注:A～C為假手術(shù)組;D～F為模型組;G～I為推拿組。

2.3 免疫熒光染色

2.3.1 各組大鼠脊髓背角GFAP表達比較 干預20天后,與假手術(shù)組相比,模型組脊髓背角星型膠質(zhì)細胞呈完全或部分活化狀態(tài),部分胞體增大,模型組GFAP免疫熒光強度顯著增強(P<0.05);與模型組相比,推拿組脊髓背角星型膠質(zhì)細胞呈未活化或部分活化狀態(tài),推拿組脊髓背角GFAP表達均明顯低于模型組(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠脊髓背角GFAP、NR2B表達(免疫熒光,50 μm)

表3 各組大鼠脊髓背角GFAP、NR2B平均熒光強度比較

2.3.2 各組大鼠脊髓背角NR2B表達比較 干預20天后,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓背角NR2B免疫熒光強度明顯增強(P<0.05),說明造模成功。與模型組比較,推拿組大鼠脊髓背角平均熒光強度顯著降低,說明推拿可顯著降低脊髓背角NR2B的表達(P<0.05)。見表3、圖2。

3 討論

3.1 CCI模型可模擬臨床NPP

周圍神經(jīng)損傷后,傷害性信息傳入脊髓,脊髓背角的突觸會發(fā)生可塑性變化,包括突觸形態(tài)和密度的變化等,是NPP產(chǎn)生痛覺過敏和觸誘發(fā)痛的病理基礎(chǔ)[8-10]。CCI模型的疼痛特征和NPP十分相似,可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸發(fā)痛等痛覺過敏[8]。實驗研究表明CCI大鼠出現(xiàn)機械痛覺過敏反應時,傷害性刺激傳入脊髓背角,會引起突觸形態(tài)的改變,加快突觸信息的傳遞,引起痛覺過敏[9]。本研究中,結(jié)合行為學和形態(tài)學結(jié)果,造模后7天大鼠機械痛閾較假手術(shù)組降低,累計疼痛評分較假手術(shù)組增加;超微結(jié)構(gòu)顯示模型組較假手術(shù)組損傷明顯,表明CCI模型制備成功。

3.2 推拿治療NPP作用顯著

推拿作為一種極具特色的中醫(yī)外治法,它通過點法、撥法、揉法等多種手法作用于患者局部,以達到舒筋通絡(luò)、理筋整復、滑利關(guān)節(jié)的作用,從而緩解疼痛、治療疾病。本研究選取三法三穴作為干預手法,能達到刺激穴位-神經(jīng)-肌肉區(qū)域的最大刺激量[10-11]。課題組前期已進行了初步探索,證明三法三穴能改善CCI大鼠的行為學表現(xiàn),緩解自發(fā)性疼痛、機械痛覺異常,抑制痛覺過敏;三法三穴還可以明顯促進超微結(jié)構(gòu)的修復和再生,促進感覺和運動功能的恢復[12-13]。本研究證實了推拿干預可以提高大鼠機械痛閾值、降低疼痛強度,還可以改變脊髓背角突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu),從而影響突觸可塑性來抑制痛覺敏化。

3.3 突觸可塑性的改變可反應推拿干預對痛覺敏化的影響

突觸是神經(jīng)元可塑性的敏感部位,其可塑性包括形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變,形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為突觸活性區(qū)數(shù)量與結(jié)構(gòu)的改變等。突觸介導神經(jīng)環(huán)路相鄰神經(jīng)元間的信息傳遞,從而影響神經(jīng)系統(tǒng)所支配的行為,如感覺功能和運動功能[16]。CCI大鼠出現(xiàn)機械痛覺過敏反應時,其脊髓Ⅱ?qū)油挥|界面曲率增大,凹型突觸顯著增加且線粒體腫脹、數(shù)量增多,線粒體多少與突觸功能活動狀態(tài)相關(guān),凹型突觸界面呈“袋狀”,可增加突觸界面曲率,提高突觸傳遞的效能,加快神經(jīng)信息傳遞,引起痛覺過敏[14]。本研究結(jié)果顯示,模型組脊髓背角超微結(jié)構(gòu)損傷明顯,膜界限不清,線粒體腫脹,嵴減少,突觸致密區(qū)變短;經(jīng)過推拿干預后,破損結(jié)構(gòu)逐漸恢復,趨完整態(tài),膜界限清晰,線粒體腫脹程度較輕,嵴存在,突觸致密區(qū)變長,逐漸趨向正常狀態(tài)。證明推拿可以使脊髓背角結(jié)構(gòu)逐漸恢復,突觸可塑性改變,突觸傳遞效能降低,疼痛逐漸緩解。

3.4 推拿可通過抑制星型膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來鎮(zhèn)痛

脊髓背角膠質(zhì)細胞與周圍神經(jīng)損傷引起的NPP關(guān)系密切[15]。GFAP是星形膠質(zhì)細胞的一種標志性蛋白,它可以維持星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的正常穩(wěn)定、促進星形膠質(zhì)細胞突起生長與延長[16]。NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體,在興奮性突觸可塑性中起著重要作用,特別是NR2B亞基,主要分布在脊髓背角,在誘導性疼痛的中樞敏化中起著重要作用[17]。NPP發(fā)生后,脊髓星形膠質(zhì)細胞可通過多種途徑激活,它可以表達NMDA等神經(jīng)遞質(zhì)的受體,增加脊髓背角中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[18]。楊松等[19]研究發(fā)現(xiàn)造模成功后,星形膠質(zhì)細胞表達較無損狀態(tài)高,其表達強度與周圍神經(jīng)損傷密切相關(guān)。ZHAO等[20]研究電針對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛機制,通過觀察脊髓背角NR2B的表達,發(fā)現(xiàn)CCI組的NR2B免疫反應細胞的數(shù)量明顯增加,通過抑制NR2B的表達,可以減輕疼痛。星形膠質(zhì)細胞活化及其神經(jīng)遞質(zhì)的釋放會導致中樞敏化和突觸重塑以維持疼痛。本研究結(jié)果顯示,模型組脊髓背角星形膠質(zhì)細胞活化明顯,GFAP和NR2B的表達增加;推拿組GFAP和NR2B表達顯著減少,說明推拿能抑制星型膠質(zhì)細胞活化,降低GFAP和NR2B的表達,能達到治療NPP的作用。

3.5 結(jié)論

根據(jù)本次研究結(jié)果得出,推拿能改變CCI大鼠的行為學和形態(tài)學,主要表現(xiàn)為提高大鼠機械縮足閾值、降低疼痛強度,促進脊髓背角超微結(jié)構(gòu)的修復和再生,改變突觸可塑性。推拿能抑制星形膠質(zhì)細胞的活化,可顯著降低脊髓背角GFAP和NR2B的表達。結(jié)合行為學和形態(tài)學結(jié)果說明推拿可以通過機械刺激改變突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和可塑性來抑制突觸信號的傳遞和星形膠質(zhì)細胞的活化,降低脊髓背角GFAP和NR2B的表達,最終抑制痛覺敏化,為研究推拿對CCI模型鼠的鎮(zhèn)痛作用提供行為學、形態(tài)學和分子生物學證據(jù),闡明了推拿治療NPP的作用機理。推拿治療NPP作用顯著,它能改善NPP的痛覺過敏、自發(fā)性疼痛等癥狀,促進感覺功能和運功功能的恢復,本研究也為推拿治療NPP的療效提供了臨床依據(jù);但未能統(tǒng)計突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的具體參數(shù),今后可進一步從Wnt/Ca2+通路出發(fā),研究突觸可塑性、星形膠質(zhì)細胞與推拿的鎮(zhèn)痛機理之間的關(guān)系,為推拿治療NPP提供科學依據(jù)和臨床指導。