酶聯免疫吸附下血清組織蛋白酶d和細胞因子對診斷非酒精性脂肪肝的臨床觀察

褚慶華 洪娟 鄭曉頡 王茜青△

(1.同濟大學附屬上海市第十人民醫院檢驗科,上海 200072;2.上海市浦東新區浦興社區衛生服務中心檢驗科,上海 200129)

脂肪肝是指脂肪在肝內的沉積超量,使肝臟細胞發生脂肪樣變性的一種疾病,其作為世界第二大肝病,已被公認為是隱蔽性肝硬化的一個重要誘因,并且朝年輕化趨勢方向發展[1]。脂肪肝按病因分為非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精性脂肪肝(AFLD),以前者較為常見。目前肝組織活檢病理是此病診斷的金標準,而組織活檢的有創性和取樣局限限制了其臨床應用[2]。組織蛋白酶家族史人溶酶體重要水解酶家族,其中組織蛋白酶D(CTSD),在細胞中發揮剪切、降解多種蛋白質和多肽的作用,并參與免疫調控進程[3]。本文探討酶聯免疫吸附下血清組織蛋白酶d(CTSD)和細胞因子對診斷非酒精性脂肪肝(NAFLD)的臨床觀察。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院及社區醫院2019年10月至2022年10月收治的NAFLD患者300例。納入標準:年齡18歲以上;脂肪肝患者診斷符合《超聲醫學》[3]對脂肪肝的診斷標準;患者知情同意。排除標準:肝癌,其他病毒性肝炎,遺傳性肝病等疾病;存在脂肪肝之外可能會對血脂、肝功能指標表達產生影響的疾病;合并心肺腎等臟器功能及呼吸功能不全;酒精性脂肪肝;智力及精神障礙者;哺乳期、孕期者;生存時間<6個月。其中男189例,女111例,年齡32～75歲,平均年齡(53.51±2.64)歲,其中輕度154例,中度97例,重度49例;同期隨機選取同期健康體檢腹部B超、生化檢查均正常的人群為健康對照組,共300例,其中男200例,女100例,年齡25～70歲,平均年齡(53.28±3.41)歲。兩組患者一般資料比較差異有統計學意義(P>0.05)。

1.2方法 所有患者于清晨空腹抽取靜脈血5 mL,置于真空無菌采血管中,以2 500 rmin-1離心10 min,分離血清后取上清置于-20℃冰柜中保存待測,標本由專人管理。監測肝功能指標,包括天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、γ谷氨酰基轉移酶(GGT)。血脂指標包括總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)。采用(儀器:日立7600全自動生化儀),具體方法為:TC采用GPO-POD法、TG選擇酶法;運用丙氨酸底物法檢測ALT,天門冬氨酸底物法檢測AST,其余肝功能指標采用速率法檢測。ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測方法,酶標儀(450 nm檢測波長濾光片,570 nm或630 nm校正波長濾光片),從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條,未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內封存于2～8℃;分別將標本或不同濃度的標準品加入相應孔中(100 μl/孔),溫育后,加入生物素標記抗體和過氧化物酶標記的鏈霉親和素。經過溫育和洗滌結合形成的免疫復合物,去除未結合的酶,然后加入顯色底物TMB。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子濃度呈正相關。最后,在450 nm處測定反應孔樣品吸光度(OD)值,通過繪制標準曲線計算出CTSD濃度、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6)。

1.3質量控制及量化標準 在檢驗開始前,嚴格按照儀器自帶的操作標準對儀器進行校準。同時,定期請計量局前來對儀器進行測定,確保測量結果的準確性。所有工作人員在上崗前均要參加培訓并通過考試。嚴格掌握各種測定方法和測定標準,減少測定誤差。血液標本的采集、離心、轉運、檢測等均嚴格按照我院生化室的要求進行。

2 結 果

2.1兩組人群的實驗室指標情況對比 NAFLD組血脂指標中TG、TC和肝功能指標中AST、ALT和GGT、CTSD均高于對照組,細胞因子中TNF-α、IL-6同樣高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組人群的實驗室指標情況對比

2.2不同程度NAFLD患者相關血清指標比較 隨著NAFLD病情嚴重程度的增加,TG、TC、AST、ALT 和 GGT 、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趨勢,各組上述指標相比差異有意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同程度NAFLD患者相關血清指標比較

2.3各項指標診斷NAFLD的ROC曲線分析 根據ROC曲線分析顯示,兩項指標在NAFLD診斷中以聯合預測診斷的價值最高,曲線下面積(AUC)(95%CI)為0.765(0.686～0.843);其中CSTD診斷價值稍高于IL-6,AUC(95%CI)為0.700(0.614～0.787)。二者P值均<0.05,說明CSTD與IL-6聯合的診斷效能最優。見圖1。

圖1 各項指標診斷NAFLD的ROC曲線

3 討 論

NAFLD是由糖脂代謝紊亂誘發的以肝細胞脂質沉積為特征的肝臟疾病[4]。NAFLD早期將對全身各系統造成影響,多種疾病與NAFLD存在發病關聯,現把NAFLD的危害從代謝綜合征擴展到全身多系統多疾病[5]。CTSD是一種蛋白質,在人類中由CTSD基因編碼。該基因編碼的是一種溶酶體天冬氨酸蛋白酶,由二硫鍵重鏈和輕鏈組成的蛋白質二聚體,都是由一個蛋白質前體產生[6]。組織蛋白酶D是一種天冬氨酸內切蛋白酶,普遍分布在溶酶體中,它的主要功能是降解蛋白質和激活溶酶體前室中生物活性蛋白的前體。臨床已有研究證實其在胃癌、結腸癌中的應用,但在NAFLD中的應用報道極少[7]。

腫瘤壞死因子(TNF),主要由活化的單核巨噬細胞產生,能殺傷和抑制腫瘤細胞促進中性粒細胞吞噬,抗感染引起發熱,誘導肝細胞急性期蛋白合成,促進細胞增殖和分化,是重要的炎癥因子。IL-6是趨化因子家族的一員,是免疫細胞作用于其它細胞所產生的蛋白質,當肝臟受到不同程度的損傷,由于肝臟對細胞因子的清除能力下降,使體內細胞因子通過血液運輸到機體各個部位導致IL-6升高。同時它由核巨噬細胞、血管內皮細胞等產生,可通過自分泌旁分泌作用于組織細胞刺激細胞生長,促細胞外基增生參與炎癥。側面反應了它與肝纖維化的程度相關。本文結果發現,隨著NAFLD病情嚴重程度的增加,TG、TC、AST、ALT和GGT、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趨勢(P<0.05),根據ROC曲線分析顯示,兩項指標在NAFLD診斷中以CSTD與IL-6聯合預測診斷的價值最高,分析其患者水平升高的原因主要為,當人體處于高膽固醇環境下,與膽固醇結合的溶媒體大量分泌,導致轉運通路紊亂,而CTSD作為溶酶體中主要的水解酶,水平也隨之升高,并定位在細胞膜附近,這就導致在肝臟發生脂肪變形時,血清CTSD水平升高[8]。

綜上,血清CTSD和細胞因子聯合檢測可以有效提高預測診斷非酒精性脂肪肝的敏感度和特異度,臨床診斷價值顯著。