基于TCGA數(shù)據(jù)庫及分子對接探討黃芪治療胃癌的作用機(jī)制

胡文杰 王鈺婷 于白莉

[摘要]?目的?探討黃芪治療胃癌的作用機(jī)制。方法?通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺檢索黃芪的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)。癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫下載胃癌基因表達(dá)譜及臨床特征數(shù)據(jù)，采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted?correlation?network?analysis，WGCNA）識別胃癌共表達(dá)模塊。將黃芪的作用靶點(diǎn)與胃癌共表達(dá)模塊、差異基因取交集。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并提取黃芪改善胃癌預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。通過GSE54129數(shù)據(jù)集、人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫、分子對接對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果?共檢索到黃芪有效活性成分16個(gè)及對應(yīng)靶點(diǎn)190個(gè)；篩選得到差異表達(dá)基因2694個(gè)，其中上調(diào)基因1124個(gè)，下調(diào)基因1570個(gè)；構(gòu)建的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)青綠色模塊與胃癌有顯著而穩(wěn)定的相關(guān)性，構(gòu)建韋恩圖得到黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)差異表達(dá)基因。PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定得到10個(gè)關(guān)鍵基因，其中，微囊蛋白1（caveolin?1，CAV1）、前列腺素E2受體EP3亞型（prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype，PTGER3）與胃癌患者的生存顯著相關(guān)。分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪活性成分與PTGER3具有較好的結(jié)合能。結(jié)論?黃芪改善胃癌預(yù)后的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)CAV1和PTGER3有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?黃芪；加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析；胃癌；生存分析；生物信息

[中圖分類號]?R735.2??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.019

The?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer?based?on?TCGA?database?and?molecular?docking

HU?Wenjie，?WANG?Yuting，?YU?Baili

Department?of?General?Practice，?Hospital?of?Chengdu?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Chengdu，?610075，?Sichuan，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer.?Methods?The?chemical?constituents?and?targets?of?astragalus?were?searched?through?traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform.?The?Cancer?Genome?Atlas?database?was?downloaded?for?gastric?cancer?gene?expression?data?and?clinical?data，?and?weighted?correlation?network?analysis?（WGCNA）?was?used?to?identify?gastric?cancer?co-expression?modules.?The?target?of?astragalus?was?intersected?with?gastric?cancer?co-expression?modules?and?differential?genes.?Potential?targets?were?validated?using?the?GSE54129?dataset，?Human?Protein?Atlas?database，?and?molecular?docking.?Results?A?total?of?16?active?ingredients?and?190?corresponding?targets?of?astragalus?were?retrieved.?2694?differentially?expressed?genes?were?screened，?of?which?1124?genes?were?up-regulated?and?1570?genes?were?down-regulated.?The?constructed?WGCNA?co-expression?network?showed?a?significant?and?stable?correlation?between?the?cyan?module?and?gastric?cancer，?and?27?differentially?expressed?genes?of?astragalus?were?obtained?by?constructing?the?Venn?diagram.?Ten?key?genes?were?identified?by?PPI?network，?among?which?caveolin?1?（CAV1）?and?prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype?（PTGER3）?were?significantly?correlated?with?the?survival?of?patients?with?gastric?cancer.?The?molecular?docking?results?showed?that?the?active?ingredients?of?astragalus?had?good?binding?energy?with?PTGER3.?Conclusion?The?mechanism?of?astragalus?improving?the?prognosis?of?gastric?cancer?may?be?related?to?regulating?CAV1?and?PTGER31.

[Key?words]?Astragalus;?Weighted?correlation?network?analysis;?Gastric?cancer;?Survival?analysis;?Bioinformatics

胃癌居全球癌癥發(fā)病譜的第5位與死因譜的第4位，據(jù)估計(jì)全球每年新增胃癌病例超過100萬例[1-2]。在中國，多數(shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病晚期，5年生存率不足50%[3]。胃癌的早期診斷較為困難，盡管采取新輔助化療、放射治療及免疫治療等多種治療手段，但其復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率仍較高[4]。因此，如何降低胃癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，減輕藥物不良反應(yīng)，改善胃癌患者預(yù)后，是臨床研究的重點(diǎn)。黃芪具有補(bǔ)氣固表、托毒生肌的功效，其抗癌機(jī)制主要圍繞調(diào)節(jié)腫瘤免疫、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤細(xì)胞遷移侵襲、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗新生血管生成及聯(lián)合化療藥物的增效減毒等方面[5-6]。研究表明黃芪提取物可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞體外增殖且通過線粒體途徑誘導(dǎo)其凋亡，但黃芪改善胃癌預(yù)后的作用靶點(diǎn)及潛在機(jī)制目前尚未明確[5]。中藥成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)較多，本文通過生物信息學(xué)揭示黃芪在胃癌預(yù)后中的潛在價(jià)值，為黃芪治療胃癌的新藥開發(fā)及質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??藥物靶點(diǎn)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到黃芪的有效活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)。對應(yīng)靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫矯正去重。

1.2??胃癌基因表達(dá)譜下載及差異分析

進(jìn)入癌癥基因組圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，下載胃癌基因表達(dá)譜及相應(yīng)臨床特征數(shù)據(jù)，去除臨床信息不全樣本，以P<0.05、|Log2FC|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的基因并建立差異表達(dá)矩陣。

1.3??加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

利用R軟件將下載的胃癌基因表達(dá)譜進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted?correlation?network?analysis，WGCNA），構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置合適的閾值（β）。將β轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（topological?overlap?matrix，TOM）及相應(yīng)的相異度（1-TOM），構(gòu)建1-TOM矩陣的層次聚類樹形圖，將相似的基因表達(dá)劃分為不同的模塊。將得到模塊中的基因靶點(diǎn)與黃芪的作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集，選取交集靶點(diǎn)最多的模塊作為目標(biāo)模塊。取目標(biāo)模塊、黃芪作用靶點(diǎn)、差異表達(dá)基因三者的交集，其共同靶點(diǎn)為黃芪改善胃癌預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。

1.4??基因功能富集分析

為了解黃芪改善胃癌患者預(yù)后的模塊基因的生物學(xué)功能，利用R軟件以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)對模塊靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene?ontology，GO）富集分析，包括生物過程、細(xì)胞成分、分子功能三部分。

1.5??蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將黃芪改善胃癌預(yù)后的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，下載TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)可視化圖。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的最大團(tuán)中心性（maximal?clique?centrality，MCC）值，MCC值高的前10個(gè)基因被認(rèn)為是黃芪改善胃癌預(yù)后的關(guān)鍵基因。

1.6??生存分析

利用R軟件，對TCGA數(shù)據(jù)庫下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Kaplan-Meier法對關(guān)鍵基因進(jìn)行單因素生存分析，比較不同基因表達(dá)水平患者的總生存時(shí)間。

1.7??數(shù)據(jù)驗(yàn)證

為驗(yàn)證關(guān)鍵基因的穩(wěn)健性，進(jìn)入基因表達(dá)綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)集GSE54129，該數(shù)據(jù)集包括111例胃癌組織和21例癌旁組織的基因表達(dá)譜芯片，利用R語言對關(guān)鍵基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。人類蛋白質(zhì)圖譜（Human?Protein?Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫提供大量特定人類組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。在HPA數(shù)據(jù)庫檢索生存相關(guān)基因，下載該基因在胃癌組織與癌旁組織中的免疫組化圖譜，明確關(guān)鍵基因在胃癌組織中的蛋白水平。

1.8??分子對接

從PubChem數(shù)據(jù)庫下載小分子化合物的mol2格式文件，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein?Data?Bank，PDB）下載大分子蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件對大分子去除原配體，去水加氫處理。將大分子與小分子配體導(dǎo)入AutoDock軟件構(gòu)建活性口袋，明確中心位點(diǎn)，進(jìn)行分子對接。

2??結(jié)果

2.1??成分靶點(diǎn)構(gòu)建

通過TCMSP得到黃芪有效活性成分16個(gè)及其對應(yīng)靶點(diǎn)190個(gè)，構(gòu)建“成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)路，見圖1。圖中節(jié)點(diǎn)代表黃芪的有效活性成分及靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連線代表成分與靶點(diǎn)的關(guān)系，由圖1可知槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、黃芪異黃烷苷（MOL000378）、刺芒柄花素（MOL000392）、異鼠李素（MOL000354）等成分為黃芪的主要活性成分。

2.2??胃癌的差異基因分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌基因表達(dá)譜，篩選得到差異表達(dá)基因2694個(gè)，其中上調(diào)基因1124個(gè)，下調(diào)基因1570個(gè)，根據(jù)結(jié)果繪制差異表達(dá)基因火山圖，見圖2。

2.3??WGCNA

基于1-TOM矩陣的基因?qū)哟尉垲悓脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊的聚類樹狀圖進(jìn)行排序，共確定14個(gè)模塊，繪制“模塊–臨床特征”熱圖。構(gòu)建的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)青綠色模塊與胃癌有顯著而穩(wěn)定的相關(guān)性，將青綠色模塊、胃癌差異表達(dá)基因、黃芪作用靶點(diǎn)取交集構(gòu)建韋恩圖，得到黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)差異表達(dá)基因，見圖3。

2.4??GO富集分析

GO富集結(jié)果顯示，黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)關(guān)鍵基因主要富集在細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)和細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程、基底質(zhì)膜和細(xì)胞基質(zhì)等細(xì)胞成分、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性和乙酰膽堿受體活性等分子功能，見圖4。

2.5??PPI網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，得到17個(gè)節(jié)點(diǎn)，74條邊，圖中紅色及黃色節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵基因，見圖5。

2.6??生存分析及HPA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

在10個(gè)關(guān)鍵基因中，微囊蛋白1（caveolin?1，CAV1）、前列腺素E2受體EP3亞型（prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype，PTGER3）與胃癌患者的生存顯著相關(guān)（P<0.05），CAV1、PTGER3高表達(dá)的胃癌患者生存率均顯著低于低表達(dá)患者，見圖6。驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE54129表明，CAV1、PTGER3在腫瘤組織中高表達(dá)（P<0.05），見圖7。

2.7??分子對接

PDB數(shù)據(jù)庫暫未收錄CAV1蛋白，無法進(jìn)行分子對接，下載PTGER3蛋白（PDB?ID：6AK3）與黃芪的主要活性成分（Degree前5）進(jìn)行分子對接，見表1。其中槲皮素與山奈酚為主要作用于PTGER3的活性成分，與靶點(diǎn)對接結(jié)合能均小于–5.0kcal/mol，表明配體分子均可與受體蛋白較好地結(jié)合。

3??討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，胃癌的發(fā)生主要取決于正氣的盛衰。黃芪為補(bǔ)藥之長，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中位列上品。研究表明，黃芪可提高人體免疫力[7]。黃芪作為單味中藥或配伍用藥在抗胃癌中應(yīng)用廣泛，但其存在有效成分、作用靶點(diǎn)、潛在機(jī)制不明確等問題，給臨床使用帶來一定困惑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制提供新策略[8]。本研究通過收集胃癌的差異表達(dá)基因得到疾病靶點(diǎn)，并構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，最后通過分子對接，HPA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多手段驗(yàn)證，為黃芪治療胃癌的作用機(jī)制提供新的見解。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚是黃芪改善胃癌預(yù)后的主要有效成分，該結(jié)果與黃芪指紋圖譜測定結(jié)果一致[9-10]。槲皮素和山奈酚均為黃酮類化合物，對腫瘤具有較好的抑制作用[11-12]。槲皮素能夠通過調(diào)控CAV1蛋白的表達(dá)有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。此外，槲皮素可通過抑制c-Jun/ATF2/Bcl-xL途徑增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對胃癌的凋亡誘導(dǎo)活性[14]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡[15]。山奈酚通過上調(diào)P53基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制PARP1基因和PARP1蛋白的表達(dá)，造成DNA損傷，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖[16-17]。槲皮素、山奈酚可作為黃芪治療胃癌的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

GO富集結(jié)果顯示，黃芪改善胃癌患者預(yù)后的27個(gè)關(guān)鍵基因主要與細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)節(jié)、活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）代謝過程有關(guān)。氧化應(yīng)激與腫瘤的關(guān)系非常復(fù)雜，ROS刺激腫瘤形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/增殖，但高水平的ROS具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。研究表明，黃芪可通過清除自由基抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制增生[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗新生血管生成的潛在作用[21]。CAV1是一種膜蛋白，在肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌等多個(gè)瘤種中高表達(dá)，其可通過糖酵解、線粒體生物能量學(xué)、谷氨酰胺分解、脂肪酸代謝和自噬等參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22-23]。CAV1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復(fù)雜的作用。胃癌早期，CAV1在胃上皮細(xì)胞的表達(dá)呈進(jìn)行性下降，而在胃癌晚期，CAV1表達(dá)上調(diào)，并與胃癌不良預(yù)后呈正相關(guān)[24-25]。生存分析發(fā)現(xiàn)，CAV1高表達(dá)提示預(yù)后不佳。研究還發(fā)現(xiàn)黃芪活性成分可逆轉(zhuǎn)si-CAV1對CAV1蛋白的抑制[26]。PTGER3是前列腺素E2作用的4種受體之一，對腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成具有促進(jìn)作用[27]。研究表明PTGER3表達(dá)上調(diào)可能參與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展，且其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良[28]。張林等[29]發(fā)現(xiàn)，黃芪主要活性成分槲皮素治療胃癌的主要靶點(diǎn)為PTGER3。分子對接結(jié)果表明，黃芪中主要活性成分能較好地與PTGER3結(jié)合。

綜上，黃芪在改善胃癌患者生存預(yù)后中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能與CAV1、PTGER3等靶點(diǎn)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗新生血管生成有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)][1] SMYTH?E?C，?NILSSON?M，?GRABSCH?H?I，?et?al.?Gastric?cancer[J].?Lancet，?2020，?396（10251）：?635–648.

[17] 王麗君，?戴志升.?山奈酚對胃癌細(xì)胞PARP1以及P53基因表達(dá)的影響研究[J].?基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，?2020，?39（03）：?1270–1274.