基于TCGA數據庫及分子對接探討黃芪治療胃癌的作用機制

胡文杰 王鈺婷 于白莉

[摘要]?目的?探討黃芪治療胃癌的作用機制。方法?通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺檢索黃芪的化學成分及作用靶點。癌癥基因組圖譜數據庫下載胃癌基因表達譜及臨床特征數據，采用加權基因共表達網絡分析（weighted?correlation?network?analysis，WGCNA）識別胃癌共表達模塊。將黃芪的作用靶點與胃癌共表達模塊、差異基因取交集。STRING數據庫構建蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡并提取黃芪改善胃癌預后的潛在靶點。通過GSE54129數據集、人類蛋白質圖譜數據庫、分子對接對潛在靶點進行驗證。結果?共檢索到黃芪有效活性成分16個及對應靶點190個；篩選得到差異表達基因2694個，其中上調基因1124個，下調基因1570個；構建的WGCNA共表達網絡發現青綠色模塊與胃癌有顯著而穩定的相關性，構建韋恩圖得到黃芪改善胃癌預后的27個差異表達基因。PPI網絡鑒定得到10個關鍵基因，其中，微囊蛋白1（caveolin?1，CAV1）、前列腺素E2受體EP3亞型（prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype，PTGER3）與胃癌患者的生存顯著相關。分子對接結果發現，黃芪活性成分與PTGER3具有較好的結合能。結論?黃芪改善胃癌預后的作用機制可能與調節CAV1和PTGER3有關。

[關鍵詞]?黃芪；加權基因共表達網絡分析；胃癌；生存分析；生物信息

[中圖分類號]?R735.2??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.019

The?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer?based?on?TCGA?database?and?molecular?docking

HU?Wenjie，?WANG?Yuting，?YU?Baili

Department?of?General?Practice，?Hospital?of?Chengdu?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Chengdu，?610075，?Sichuan，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer.?Methods?The?chemical?constituents?and?targets?of?astragalus?were?searched?through?traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform.?The?Cancer?Genome?Atlas?database?was?downloaded?for?gastric?cancer?gene?expression?data?and?clinical?data，?and?weighted?correlation?network?analysis?（WGCNA）?was?used?to?identify?gastric?cancer?co-expression?modules.?The?target?of?astragalus?was?intersected?with?gastric?cancer?co-expression?modules?and?differential?genes.?Potential?targets?were?validated?using?the?GSE54129?dataset，?Human?Protein?Atlas?database，?and?molecular?docking.?Results?A?total?of?16?active?ingredients?and?190?corresponding?targets?of?astragalus?were?retrieved.?2694?differentially?expressed?genes?were?screened，?of?which?1124?genes?were?up-regulated?and?1570?genes?were?down-regulated.?The?constructed?WGCNA?co-expression?network?showed?a?significant?and?stable?correlation?between?the?cyan?module?and?gastric?cancer，?and?27?differentially?expressed?genes?of?astragalus?were?obtained?by?constructing?the?Venn?diagram.?Ten?key?genes?were?identified?by?PPI?network，?among?which?caveolin?1?（CAV1）?and?prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype?（PTGER3）?were?significantly?correlated?with?the?survival?of?patients?with?gastric?cancer.?The?molecular?docking?results?showed?that?the?active?ingredients?of?astragalus?had?good?binding?energy?with?PTGER3.?Conclusion?The?mechanism?of?astragalus?improving?the?prognosis?of?gastric?cancer?may?be?related?to?regulating?CAV1?and?PTGER31.

[Key?words]?Astragalus;?Weighted?correlation?network?analysis;?Gastric?cancer;?Survival?analysis;?Bioinformatics

胃癌居全球癌癥發病譜的第5位與死因譜的第4位，據估計全球每年新增胃癌病例超過100萬例[1-2]。在中國，多數胃癌患者被發現時已處于疾病晚期，5年生存率不足50%[3]。胃癌的早期診斷較為困難，盡管采取新輔助化療、放射治療及免疫治療等多種治療手段，但其復發率與轉移率仍較高[4]。因此，如何降低胃癌術后的復發率和轉移率，減輕藥物不良反應，改善胃癌患者預后，是臨床研究的重點。黃芪具有補氣固表、托毒生肌的功效，其抗癌機制主要圍繞調節腫瘤免疫、抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤細胞遷移侵襲、誘導腫瘤細胞凋亡、抗新生血管生成及聯合化療藥物的增效減毒等方面[5-6]。研究表明黃芪提取物可抑制人胃癌SGC-7901細胞體外增殖且通過線粒體途徑誘導其凋亡，但黃芪改善胃癌預后的作用靶點及潛在機制目前尚未明確[5]。中藥成分復雜，作用靶點較多，本文通過生物信息學揭示黃芪在胃癌預后中的潛在價值，為黃芪治療胃癌的新藥開發及質量評價提供依據。

1??材料與方法

1.1??藥物靶點

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選標準，得到黃芪的有效活性成分及對應靶點。對應靶點通過UniProt數據庫矯正去重。

1.2??胃癌基因表達譜下載及差異分析

進入癌癥基因組圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數據庫，下載胃癌基因表達譜及相應臨床特征數據，去除臨床信息不全樣本，以P<0.05、|Log2FC|>1為篩選標準篩選差異表達的基因并建立差異表達矩陣。

1.3??加權基因共表達網絡分析

利用R軟件將下載的胃癌基因表達譜進行加權基因共表達網絡分析（weighted?correlation?network?analysis，WGCNA），構建無標度網絡，設置合適的閾值（β）。將β轉換為拓撲重疊矩陣（topological?overlap?matrix，TOM）及相應的相異度（1-TOM），構建1-TOM矩陣的層次聚類樹形圖，將相似的基因表達劃分為不同的模塊。將得到模塊中的基因靶點與黃芪的作用靶點進行交集，選取交集靶點最多的模塊作為目標模塊。取目標模塊、黃芪作用靶點、差異表達基因三者的交集，其共同靶點為黃芪改善胃癌預后的潛在靶點。

1.4??基因功能富集分析

為了解黃芪改善胃癌患者預后的模塊基因的生物學功能，利用R軟件以P<0.05為篩選標準對模塊靶點進行基因本體論（gene?ontology，GO）富集分析，包括生物過程、細胞成分、分子功能三部分。

1.5??蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將黃芪改善胃癌預后的靶點導入STRING數據庫構建蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡，下載TSV格式文件，導入Cytoscape軟件構建PPI網絡可視化圖。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件計算每個節點的最大團中心性（maximal?clique?centrality，MCC）值，MCC值高的前10個基因被認為是黃芪改善胃癌預后的關鍵基因。

1.6??生存分析

利用R軟件，對TCGA數據庫下載的基因表達數據和臨床數據進行分析，采用Kaplan-Meier法對關鍵基因進行單因素生存分析，比較不同基因表達水平患者的總生存時間。

1.7??數據驗證

為驗證關鍵基因的穩健性，進入基因表達綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數據庫下載數據集GSE54129，該數據集包括111例胃癌組織和21例癌旁組織的基因表達譜芯片，利用R語言對關鍵基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達進行驗證。人類蛋白質圖譜（Human?Protein?Atlas，HPA）數據庫提供大量特定人類組織和細胞的轉錄組和蛋白質組學數據。在HPA數據庫檢索生存相關基因，下載該基因在胃癌組織與癌旁組織中的免疫組化圖譜，明確關鍵基因在胃癌組織中的蛋白水平。

1.8??分子對接

從PubChem數據庫下載小分子化合物的mol2格式文件，蛋白質結構數據庫（Protein?Data?Bank，PDB）下載大分子蛋白結構，利用PyMOL軟件對大分子去除原配體，去水加氫處理。將大分子與小分子配體導入AutoDock軟件構建活性口袋，明確中心位點，進行分子對接。

2??結果

2.1??成分靶點構建

通過TCMSP得到黃芪有效活性成分16個及其對應靶點190個，構建“成分–靶點”網路，見圖1。圖中節點代表黃芪的有效活性成分及靶點，節點與節點之間的連線代表成分與靶點的關系，由圖1可知槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、黃芪異黃烷苷（MOL000378）、刺芒柄花素（MOL000392）、異鼠李素（MOL000354）等成分為黃芪的主要活性成分。

2.2??胃癌的差異基因分析

從TCGA數據庫下載胃癌基因表達譜，篩選得到差異表達基因2694個，其中上調基因1124個，下調基因1570個，根據結果繪制差異表達基因火山圖，見圖2。

2.3??WGCNA

基于1-TOM矩陣的基因層次聚類對共表達網絡模塊的聚類樹狀圖進行排序，共確定14個模塊，繪制“模塊–臨床特征”熱圖。構建的WGCNA共表達網絡發現青綠色模塊與胃癌有顯著而穩定的相關性，將青綠色模塊、胃癌差異表達基因、黃芪作用靶點取交集構建韋恩圖，得到黃芪改善胃癌預后的27個差異表達基因，見圖3。

2.4??GO富集分析

GO富集結果顯示，黃芪改善胃癌預后的27個關鍵基因主要富集在細胞對化學應激的反應和細胞對氧化應激的反應等生物過程、基底質膜和細胞基質等細胞成分、G蛋白耦聯神經遞質受體活性和乙酰膽堿受體活性等分子功能，見圖4。

2.5??PPI網絡

STRING數據庫構建PPI網絡，得到17個節點，74條邊，圖中紅色及黃色節點為關鍵基因，見圖5。

2.6??生存分析及HPA數據庫驗證

在10個關鍵基因中，微囊蛋白1（caveolin?1，CAV1）、前列腺素E2受體EP3亞型（prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype，PTGER3）與胃癌患者的生存顯著相關（P<0.05），CAV1、PTGER3高表達的胃癌患者生存率均顯著低于低表達患者，見圖6。驗證數據集GSE54129表明，CAV1、PTGER3在腫瘤組織中高表達（P<0.05），見圖7。

2.7??分子對接

PDB數據庫暫未收錄CAV1蛋白，無法進行分子對接，下載PTGER3蛋白（PDB?ID：6AK3）與黃芪的主要活性成分（Degree前5）進行分子對接，見表1。其中槲皮素與山奈酚為主要作用于PTGER3的活性成分，與靶點對接結合能均小于–5.0kcal/mol，表明配體分子均可與受體蛋白較好地結合。

3??討論

中醫學認為“正氣存內，邪不可干”，胃癌的發生主要取決于正氣的盛衰。黃芪為補藥之長，在《神農本草經》中位列上品。研究表明，黃芪可提高人體免疫力[7]。黃芪作為單味中藥或配伍用藥在抗胃癌中應用廣泛，但其存在有效成分、作用靶點、潛在機制不明確等問題，給臨床使用帶來一定困惑。網絡藥理學的發展為揭示中藥多成分、多靶點、多通路的作用機制提供新策略[8]。本研究通過收集胃癌的差異表達基因得到疾病靶點，并構建加權基因共表達網絡，最后通過分子對接，HPA數據庫進行多手段驗證，為黃芪治療胃癌的作用機制提供新的見解。

本研究發現，槲皮素、山奈酚是黃芪改善胃癌預后的主要有效成分，該結果與黃芪指紋圖譜測定結果一致[9-10]。槲皮素和山奈酚均為黃酮類化合物，對腫瘤具有較好的抑制作用[11-12]。槲皮素能夠通過調控CAV1蛋白的表達有效抑制胃癌細胞的增殖和侵襲[13]。此外，槲皮素可通過抑制c-Jun/ATF2/Bcl-xL途徑增強5-氟尿嘧啶對胃癌的凋亡誘導活性[14]。細胞實驗同樣發現，槲皮素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導MKN45細胞凋亡[15]。山奈酚通過上調P53基因促進細胞凋亡，并抑制PARP1基因和PARP1蛋白的表達，造成DNA損傷，從而抑制胃癌細胞增殖[16-17]。槲皮素、山奈酚可作為黃芪治療胃癌的潛在物質基礎。

GO富集結果顯示，黃芪改善胃癌患者預后的27個關鍵基因主要與細胞對氧化應激的反應、細胞凋亡負調節、活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）代謝過程有關。氧化應激與腫瘤的關系非常復雜，ROS刺激腫瘤形成，促進腫瘤細胞的轉化/增殖，但高水平的ROS具有細胞毒性，可導致腫瘤細胞凋亡[18]。研究表明，黃芪可通過清除自由基抑制氧化應激，促進腫瘤細胞凋亡及抑制增生[19-20]。

本研究發現黃芪具有抗腫瘤轉移和抗新生血管生成的潛在作用[21]。CAV1是一種膜蛋白，在肝癌、結腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌等多個瘤種中高表達，其可通過糖酵解、線粒體生物能量學、谷氨酰胺分解、脂肪酸代謝和自噬等參與促進腫瘤的發生發展[22-23]。CAV1在胃癌的發生發展過程中發揮復雜的作用。胃癌早期，CAV1在胃上皮細胞的表達呈進行性下降，而在胃癌晚期，CAV1表達上調，并與胃癌不良預后呈正相關[24-25]。生存分析發現，CAV1高表達提示預后不佳。研究還發現黃芪活性成分可逆轉si-CAV1對CAV1蛋白的抑制[26]。PTGER3是前列腺素E2作用的4種受體之一，對腫瘤轉移和血管生成具有促進作用[27]。研究表明PTGER3表達上調可能參與腸型胃癌的發生發展，且其高表達提示患者預后不良[28]。張林等[29]發現，黃芪主要活性成分槲皮素治療胃癌的主要靶點為PTGER3。分子對接結果表明，黃芪中主要活性成分能較好地與PTGER3結合。

綜上，黃芪在改善胃癌患者生存預后中發揮重要作用，其機制可能與CAV1、PTGER3等靶點的抗腫瘤轉移和抗新生血管生成有關。

[參考文獻][1] SMYTH?E?C，?NILSSON?M，?GRABSCH?H?I，?et?al.?Gastric?cancer[J].?Lancet，?2020，?396（10251）：?635–648.

[17] 王麗君，?戴志升.?山奈酚對胃癌細胞PARP1以及P53基因表達的影響研究[J].?基因組學與應用生物學，?2020，?39（03）：?1270–1274.