白色擬青霉分離鑒定及優(yōu)勢(shì)毒力菌株篩選

黃漢成， 吳天樂(lè)， 陳紹基， 陸航瓊， 周榮瓊

1. 西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2. 西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460

昆蟲(chóng)致病真菌附著于昆蟲(chóng)體表及體內(nèi), 迅速增殖并致寄主死亡[1]． 真菌孢子附著并侵入昆蟲(chóng)體壁后在體腔內(nèi)繁殖, 菌絲利用宿主組織營(yíng)養(yǎng)不斷生長(zhǎng), 最終導(dǎo)致蟲(chóng)體死亡． 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 全球已記載的昆蟲(chóng)病原真菌約100屬800多種[2]． 我國(guó)目前已經(jīng)報(bào)道的昆蟲(chóng)致病真菌約400多種, 其中寄生性昆蟲(chóng)致病真菌約200多種[3], 主要經(jīng)昆蟲(chóng)體壁入侵到宿主體內(nèi), 有時(shí)也可以經(jīng)呼吸道和消化道感染[4-5]． 在昆蟲(chóng)病原真菌入侵寄主時(shí), 寄主也會(huì)通過(guò)自身的體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 對(duì)真菌入侵具有一定的防御能力． 在自然界中由真菌引起的流行病可自然制約昆蟲(chóng)的種群數(shù)量, 因此利用昆蟲(chóng)病原真菌進(jìn)行生物防治已受到人們的青睞和重視．

擬青霉屬Simplicillium是21世紀(jì)初由生命科學(xué)家劃分出的一個(gè)新屬, 是一類寄生性真菌, 屬于肉座菌目Hypocreales蟲(chóng)草科Cordycipitaceae．Simplicillium屬的分生孢子具球形粘性末端, 透明, 呈橢圓形、 紡錘形或圓柱形等形態(tài)[6-8]．Simplicillium屬真菌廣泛分布于自然生態(tài)系統(tǒng)中, 通常可寄生于植物組織、 土壤、 線蟲(chóng)及真菌蘑菇中[9-10], 在生物防控和生物活性化合物應(yīng)用上具有非常重要的作用, 因此該菌具有較高的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值．

為了解土壤真菌的多樣性和分布情況, 本試驗(yàn)采用平板稀釋法, 利用選擇性培養(yǎng)基從土壤中分離并鑒定白色擬青霉S.lanosoniveum菌株; 同時(shí)采用孢子浸漬法[11]篩選出對(duì)家蠶3齡幼蟲(chóng)具有高毒力的優(yōu)勢(shì)菌株, 以期為白色擬青霉S.lanosoniveum菌株的生物防治奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)分別從重慶市榮昌區(qū)普通土壤、 玉米地土壤、 香蕉地土壤、 柑橘樹(shù)土壤和李子樹(shù)土壤這5種土壤類型中采集了6個(gè)土壤樣本(表1)． 采集樣本時(shí), 需先鏟去表層約5 cm土壤, 采集5～20 cm深度的土壤, 過(guò)濾除去沙石, 裝進(jìn)塑料袋中做好標(biāo)簽, 4 ℃條件保存?zhèn)溆茫?球孢白僵菌Beauveriabassiana購(gòu)自廣州多宇多生物科技有限公司． 金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae購(gòu)自重慶聚立信生物工程有限公司． 家蠶Bombyxmori由家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南大學(xué))提供, 飼養(yǎng)于16 cm×10 cm×8 cm透氣打孔飼養(yǎng)盒中, 需每天更換新鮮桑葉飼養(yǎng)．

表1 6株Simplicillium lanosoniveum菌株來(lái)源

PCR試劑(MgCl2、 Buffer、 dNTPs等)、 rTaq酶、 pMDTM19-T Vector、 DL 2000 DNA Marker、 瓊脂糖、 Amp、 X-gal、 IPTG購(gòu)自大連寶生物公司; 蛋白胨Tryptone、 酵母提取物Yeast extract購(gòu)自O(shè)xiod公司; 蛋白酶K購(gòu)自Merk公司; DNA凝膠回收試劑盒、 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TransGen Biotech公司; 重組質(zhì)粒WizardTMPlus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒購(gòu)自Promega公司．

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

稱取5 g土壤樣本, 加入滅菌蒸餾水45 mL, 于漩渦振蕩器振蕩5 min, 使震蕩液散布均勻后稀釋10倍． 移液槍吸取0.5 mL振蕩液涂布于馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基(PPDA), 放置在27 ℃恒溫保濕箱內(nèi)培養(yǎng), 待平板生長(zhǎng)出單菌落后挑取轉(zhuǎn)至馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA), 需至少挑取3次以上PDA培養(yǎng)基單菌落才可純化目的菌株．

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的菌落接種于PDA培養(yǎng)基中央, 27 ℃恒溫保濕箱內(nèi)培養(yǎng), 定期觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄其顏色、 形態(tài), 參考文獻(xiàn)[12]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定．

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

(1) 菌株DNA提取

刮取適量真菌分生孢子或菌絲于裂解管內(nèi), 加入270 μL的SDS裂解液[13]和30 μL(50 μg/μL)蛋白酶K充分混勻, 隔夜55 ℃水浴12～24 h, 其間多次振蕩混勻離心管使其裂解充分, 采用酚/氯仿法抽提樣本DNA． 提取出的DNA 樣品分裝后, 于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2) PCR擴(kuò)增

參考Chen等[14]的真菌ITS(Internal Transcribed Spacer, ITS)引物擴(kuò)增序列, 該序列段位于18SrRNA和28S rRNA的保守區(qū), 核苷酸序列為: ITS-F: 5’-TAACAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’ (21 bp); ITS-R: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (20 bp); 引物由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成． 使用時(shí)加滅菌超純水稀釋, 稀釋度為10 μmol/μL, 分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆茫?PCR反應(yīng)體系為25 μL, 其中3 μL Mg2+(25 mmol/L), 2.0 μL dNTPs(2.5 μmol/L), 2.5 μL 10×PCR buffer(不含Mg2+), 0.5 μL上游引物ITS-F(10 μmol/L), 0.5 μL下游引物ITS-R(10 μmol/L), 2.0 μL模板DNA, 0.2 μL rTaq酶(5 U/μL), 滅菌雙蒸水14.3 μL． 反應(yīng)在PCR儀BIO RAD S1000上進(jìn)行, 預(yù)期擴(kuò)增片段約為600 bp． 反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性94 ℃ 3 min, 變性94 ℃ 1 min, 退火溫度56 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 1 min, 循環(huán)反應(yīng)35次, 最后72 ℃延伸10 min, 同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組． PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L TAE瓊脂糖凝膠電泳后, 成像系統(tǒng)顯示記錄分析結(jié)果．

(3) PCR產(chǎn)物的克隆

按照北京全式金生物公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit說(shuō)明書進(jìn)行凝膠回收． 將回收的PCR產(chǎn)物與pMDTM19-T Vector載體連接: 取PCR管依次加入5 μL Ligation Solution I, 1 μL pMDTM19-T Vector 載體, 3 μL PCR純化產(chǎn)物, 1 μL ddH2O, 混勻, 16 ℃ PCR擴(kuò)增儀連接1 h． 連接后將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 涂布于含Amp、 X-gal和IPTG的LB瓊脂平板中, 置恒溫箱37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12～14 h后, 篩選陽(yáng)性克隆．

(4) 測(cè)序與序列分析

挑取陽(yáng)性克隆菌液送重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序． 將測(cè)序結(jié)果于美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì), 同時(shí)基于ITS下載了不同的序列:S.lanosoniveum(GeneBank NO. KT878334、 MT001191),S.cylindrosporum(GeneBank NO. NR_111023),S.obclavatum(GeneBank NO. NR_111099),S.lamellicola(GeneBank NO. NR_111098),S.chinense(GeneBank NO. NR_155782),S.minatense(GeneBank NO. NR_111025),S.subtropicum(GeneBank NO. NR_111024),S.aogashimaense(GeneBank NO. NR_111026)和S.sympodiophorum(GeneBank NO. NR_111027);Lecanicilliumkalimantanense(GeneBank NO. NR_121200),L.araneicola(GeneBank NO. NR_121208),L.primulinum(GeneBank NO. NR_119418)和枝頂孢屬Acremoniumsp.(GeneBank NO. EF577237)． 采用MegAlign 5.0的鄰接法構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù), 進(jìn)化樹(shù)的可靠性用Bootstrap進(jìn)行分析, 共1 000個(gè)重復(fù)．

1.2.4S.lanosoniveum優(yōu)勢(shì)毒力菌株篩選

(1) 孢子懸液制備

菌株分生孢子在PDA培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿, 加入滅菌的0.05%吐溫-80, 將分生孢子連同孢子梗一同刮下, 置于錐形瓶中, 振蕩器振蕩30 min使分生孢子和菌絲分離, 3層紗布過(guò)濾獲得孢子懸液． 用血球計(jì)數(shù)板將孢子含量調(diào)成1×108個(gè)孢子/mL．

(2) 優(yōu)勢(shì)毒力菌株篩選

采用孢子液浸漬法[11]對(duì)家蠶3齡幼蟲(chóng)毒力進(jìn)行測(cè)定． 挑選大小相近的健康試蟲(chóng), 將其浸入孢子懸液中約6 s, 取出用濾紙吸干多余水分后, 放回培養(yǎng)盒, 飼養(yǎng)溫度為(25±1) ℃, 相對(duì)濕度為90%, 每天及時(shí)飼養(yǎng)新鮮桑葉并清理糞便顆粒, 發(fā)現(xiàn)病死蟲(chóng)體即挑出, 保持飼養(yǎng)環(huán)境干凈． 每天記錄家蠶3齡幼蟲(chóng)的死亡情況, 連續(xù)觀察12 d． 每處理3個(gè)重復(fù), 每盒30頭． 陰性對(duì)照組為0.05%吐溫-80無(wú)菌水代替孢子懸浮液浸蟲(chóng), 篩選出高致病力菌株． 陽(yáng)性對(duì)照組為球孢白僵菌B.bassiana和金龜子綠僵菌M.anisopliae, 以及陰性對(duì)照組(CK)所需的0.05%吐溫-80無(wú)菌水, 以評(píng)估S.lanosoniveum的致病效果．

(3) 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用 Excel(2010)先計(jì)算出接種后家蠶的死亡率及僵蟲(chóng)率, 用DPS(V 9.01)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù), 求出毒力回歸方程, 計(jì)算其致死中時(shí)間LT50(median lethal time), 據(jù)此分析菌株的毒力[15]． 死亡率和校正死亡率的計(jì)算采用Abbott公式校正[16]．

公式為:

A=(a/Z)×100%

B=(b-c)/(1-c)×100%

式中:A代表死亡率,a代表死亡蟲(chóng)數(shù),Z代表供試蟲(chóng)數(shù),B代表校正死亡率,b代表處理死亡率,c代表對(duì)照死亡率．

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株分離純化培養(yǎng)2周后, 菌落正面呈白色, 直徑約8 cm, 圓形, 有同心環(huán)紋, 發(fā)達(dá)的絨毛狀菌絲, 奶油絮狀或棉花樣, 質(zhì)地粗厚干燥, 結(jié)構(gòu)致密, 不透明; 發(fā)育成熟過(guò)程中背面菌落由白色變?yōu)榈S色, 呈放射狀裂紋(圖1)． 根據(jù)上述形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果, 初步判定分離所得的6株土壤分離株為蟲(chóng)草科Cordycipitaceae,Simplicillium屬真菌． 將本次試驗(yàn)的土壤分離株分別編號(hào)為S.lanosoniveum-Sl01,Sl02,Sl03,Sl04,Sl05,Sl06．

圖1 S. lanosoniveum 在PDA培養(yǎng)基上的生物學(xué)形態(tài)

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

為進(jìn)一步確定樣本菌株的種屬地位, 本文基于ITS序列進(jìn)行了分子鑒定． 結(jié)果顯示, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后, 6株菌株均擴(kuò)增出約616 bp的條帶(圖2a); 陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)菌液 PCR 同樣擴(kuò)增出大約616 bp的ITS序列條帶(圖2b)． 擴(kuò)增條帶與預(yù)期片段大小相符, 陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)條帶．

M: DL 2000 Marker; 1: Sl01菌株; 2: Sl02菌株; 3: Sl03菌株; 4: Sl04菌株; 5: Sl05菌株; 6: Sl06菌株; 7: 陰性對(duì)照．

2.3 種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組菌液進(jìn)行測(cè)序． 結(jié)果顯示, 6株菌株獲得的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度一致, 均為616 bp． 經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì), 本研究獲得的真菌ITS序列與S.lanosoniveum(GeneBank NO. KT878334、 MT001191)的同源性達(dá)99.9%～100%; 對(duì)本次研究所得的6株S.lanosoniveum序列與下載的14株序列應(yīng)用程序軟件MegAlign 5.0 中的Neighbour-Joining構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3), 結(jié)果顯示6株S.lanosoniveum與GeneBank登記的S.lanosoniveum(GeneBank NO. KT878334、 MT001191)位于同一個(gè)分支上, 表明其遺傳距離最近; 與Acremoniumsp. (GeneBank NO. EF577237)的遺傳距離最遠(yuǎn)．

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的S. lanosoniveum系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 S. lanosoniveum優(yōu)勢(shì)毒力菌株的篩選

家蠶3齡幼蟲(chóng)接種不同菌株后累積死亡率見(jiàn)圖4． 不同菌株對(duì)家蠶3齡幼蟲(chóng)均具有致病性, 累積死亡率隨被侵染時(shí)間延長(zhǎng)而增大． 累積校正死亡率可以反映出毒株致病力的強(qiáng)弱, 累積校正死亡率越高, 致病力越強(qiáng)． 球孢白僵菌對(duì)照組累積校正死亡率最高, 達(dá)92.30%; 接種分離菌株S.lanosoniveum-Sl05,Sl06后第8 d累積校正死亡率大于80.00%, 而其余4株S.lanosoniveum-Sl01,Sl02,Sl03,Sl04累積校正死亡率分別為30.78%,61.54%,46.15%,69.23%．

圖4 接種不同菌株后家蠶3齡幼蟲(chóng)累積死亡率

不同菌株對(duì)家蠶3齡幼蟲(chóng)的毒力回歸方程如表2所示． 其中,S.lanosoniveum-Sl05,Sl06致死中時(shí)LT50分別為3.96 d和3.73 d, 小于其他同期S.lanosoniveum菌株處理組． 雖然S.lanosoniveum-Sl04致死中時(shí)LT50為4.11 d, 同樣具有優(yōu)勢(shì), 但是累積校正死亡率為69.23%, 相對(duì)較低． 陽(yáng)性對(duì)照組球孢白僵菌和金龜子綠僵菌LT50分別為3.92 d和3.63 d．

表2 S. lanosoniveum優(yōu)勢(shì)毒力菌株篩選

綜合校正死亡率和致死中時(shí)兩個(gè)指標(biāo), 在6株樣本菌株中S.lanosoniveum-Sl06的校正死亡率最高, 為89.29%, 致死中時(shí)(LT50)最短, 為3.73 d．S.lanosonievum-Sl05次之, 校正死亡率為84.62%, 致死中時(shí)(LT50)為3.96 d． 這兩株菌株表現(xiàn)出良好的毒力活性, 是S.lanosoniveum家蠶3齡幼蟲(chóng)致病的優(yōu)勢(shì)菌株．

3 討論

土壤中昆蟲(chóng)致病真菌種類繁多, 其中最大生防類群的蟲(chóng)生真菌占比達(dá)60%以上, 表明土壤能為蟲(chóng)生真菌研究提供最基礎(chǔ)且最豐富的來(lái)源[17]．Simplicillium屬真菌在土壤、 海水、 空氣等環(huán)境中的生活模式豐富多樣[14], 可作為共生真菌、 內(nèi)生真菌、 昆蟲(chóng)致病真菌和真菌寄生菌被分離出來(lái)． 土壤中蟲(chóng)生真菌菌株的分離方法通常有兩種, 即僵蟲(chóng)分離法和土壤分離法[18]． 其中, 土壤分離法更加簡(jiǎn)便易行、 環(huán)保有效, 故常被研究人員使用． 王品[19]利用選擇性培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)平板技術(shù), 對(duì)我國(guó)4大茶區(qū)茶園土壤中的蟲(chóng)生真菌進(jìn)行分離, 成功分離出4屬11種蟲(chóng)生真菌菌株． 本試驗(yàn)同樣采用土壤分離法成功分離出了6株S.lanosonievum菌株, 表明土壤中存在一定數(shù)量的昆蟲(chóng)致病真菌, 且使用土壤分離法確實(shí)簡(jiǎn)便易行． 據(jù)耿敬可等[20]的研究報(bào)道, 蟲(chóng)生真菌的種屬特異性較強(qiáng), 其宿主譜和毒力會(huì)因菌株不同而呈現(xiàn)出差異． 因此, 對(duì)土壤中更多未知菌種進(jìn)行分類鑒定, 將有利于豐富和增加蟲(chóng)生真菌資源庫(kù)的資源．

真菌種類的鑒定包括形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定． 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定主要是通過(guò)對(duì)培養(yǎng)后真菌的菌落形態(tài)和顯微鏡下分生孢子、 菌絲等的生長(zhǎng)特征來(lái)進(jìn)行鑒別[15]． 由于生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件或者環(huán)境不同, 真菌生長(zhǎng)形態(tài)會(huì)發(fā)生改變, 并且自然界中真菌種類繁多, 存在許多外觀相似的物種, 若只進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的屬種分類, 而分子生物學(xué)技術(shù)則能很好地解決近緣種之間分類難的問(wèn)題． 分子鑒定中常用18SrDNA,ITS和線粒體序列[21]等對(duì)真菌進(jìn)行鑒定． 其中, 核糖體r DNA中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS在真菌種內(nèi)高度保守, 而在種間具有顯著而豐富的變化[22], 在真菌物種親緣關(guān)系的研究中具有很高的參考價(jià)值, 因此被廣泛應(yīng)用于真菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究[23]． Chen等[14]從中國(guó)西南地區(qū)分離純化出3種新的Simplicillium屬菌株, 命名為S.cicadellidae,S.formicidae和S.lepidopterorum． 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析, 最終確定為3個(gè)新物種, 從而豐富了中國(guó)西南地區(qū)的蟲(chóng)生真菌資源． Baiswar等[24]從印度闊葉樹(shù)患病葉片中分離出一株昆蟲(chóng)致病真菌, 經(jīng)掃描電鏡下形態(tài)表征、 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析, 也鑒定為S.lanosonievum． 本試驗(yàn)從不同土壤中獲得6株真菌, 經(jīng)ITS克隆測(cè)序, 結(jié)果長(zhǎng)度均為616 bp, 表明ITS序列具有較高的保守性． 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析顯示, 6株真菌與已登錄的S.lanosoniveum(GeneBank NO. KT878334、 MT001191)位于同一分支, 相似性為99.9%～100%, 與S.minatense親緣關(guān)系最近, 而與形態(tài)相似的枝頂孢屬Acremoniumsp.親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 表明ITS序列種內(nèi)差異較小, 種間差異大, 可作為S.lanosoniveum菌株鑒定的遺傳標(biāo)記．

昆蟲(chóng)病原真菌是昆蟲(chóng)病原微生物中最大的類群, 所產(chǎn)生的流行病對(duì)自然界中害蟲(chóng)種群數(shù)量的控制具有關(guān)鍵性作用． 因此, 尋找高毒力的蟲(chóng)生真菌菌株, 開(kāi)發(fā)以其為主要成分的真菌殺蟲(chóng)劑具有廣闊的應(yīng)用前景． Sujithra等[25]從褶皺螺旋粉虱若蟲(chóng)尸體中分離出一株昆蟲(chóng)致病真菌, 鑒定為S.lanosonievum; 以浸漬接種法對(duì)粉虱發(fā)育的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行毒力測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)其對(duì)粉虱蟲(chóng)卵、 1～3齡若蟲(chóng)和蛹等階段均具有較高的毒力． 孫明等[26]從土壤中分離的球孢白僵菌, 篩選出了對(duì)多種蜱致死率達(dá)100%的高毒力菌株． 本試驗(yàn)獲得的6株S.lanosoniveum毒力有所差異, 其中S.lanosonievum-Sl05,Sl06對(duì)家蠶3齡幼蟲(chóng)的累積校正死亡率大于80.00%, 最高可達(dá)89.29%, 具備較高的毒力, 說(shuō)明本研究從土壤中分離篩選的昆蟲(chóng)病原真菌具有生物防治的應(yīng)用前景．

4 結(jié)論

從土壤中分離的6株真菌, 經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為S.lanosoniveu真菌, 其中S.lanosoniveum-Sl06和S.lanosonievum-Sl05菌株感染家蠶3齡幼蠶, 兩株菌株均表現(xiàn)出良好的毒力活性, 是S.lanosoniveum致病家蠶3齡幼蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)菌株．