Cre-miR171在柑橘響應干旱脅迫中的作用

馮繼鵬， 胡洲， 張曼曼， 汪小利，易倩， 朱世平， 趙曉春

1. 西南大學 柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712；2. 西部(重慶)科學城種質創制大科學中心，重慶 401329

柑橘是我國最重要的水果, 主要種植在南方各省市的山地和丘陵地區． 柑橘產區橫跨幾個氣候帶, 許多柑橘產區的降雨量季節分配不均勻, 因此季節性缺水造成的干旱是制約我國許多地區柑橘產業發展的一個主要因素[1]． 植物有多種抗旱和耐旱機制應對干旱脅迫, 以維持正常的生長和發育． 近年的研究發現, 一些小分子RNA不僅與植物的生長發育密切相關, 而且在植物的抗旱中也發揮著至關重要的作用[2]． 小分子RNA主要有3種類型, siRNAs,miRNAs和piRNAs, 其中miRNAs是目前生物體內存在最廣泛的, 也是研究最多的一類小RNA． 這些小RNA長度大約在20～24個核苷酸, 它們通過堿基互補配對與靶基因結合, 進而在轉錄后水平調控基因表達, 促使mRNA降解或抑制其翻譯, 起負調控靶基因的作用[3-4]． miRNA通過調控靶基因參與植物的生長發育和逆境響應[5], 許多研究報道指出, 有多種miRNA參與植物的干旱脅迫響應． miR196g是最早在水稻中被發現的與干旱相關的miRNA[6], 豇豆中發現了有近20個miRNA以不同的方式響應干旱脅迫[7], 干旱逆境誘導碧桃葉片及根部中262和368個miRNA差異表達[8], miR168和miR396在擬南芥和煙草中的表達也受干旱脅迫誘導[9]． 在模式植物擬南芥中, miR171在干旱、 低溫、 低氧、 低磷、 低硫等脅迫下表達量都會發生變化[10]． 豆科植物中miR171也響應干旱脅迫[11]． 在水稻中, 過表達osa-miR171f可以通過調控類黃酮生物合成基因的表達來增強水稻的耐旱性[12], 它通過調節SCL6-I和SCL6-II的轉錄水平在抗旱性中發揮作用． 在蘋果中, 敲除mdm-miR171i和過表達它的靶基因MsSCL26.1均可增強其抗旱性[13]． 進一步研究發現, mdm-miR171通過調節抗氧化基因表達和抗壞血酸代謝來響應干旱脅迫． 以上研究結果表明, miR171家族成員響應植物的干旱脅迫． 目前的研究表明, miR171家族的功能高度保守． 因此可以推測柑橘中的Cre-miR171也可能響應干旱脅迫, 但柑橘中Cre-miR171是否響應干旱脅迫以及調控的靶基因的研究還未見報道．

為明確Cre-miR171對柑橘耐旱的作用, 本研究通過對Cre-miR171在不同柑橘砧木品種、 組織及根系不同部位、 發育時期的表達特征進行分析, 對Cre-miR171過表達的柑橘砧木枳和模式植物擬南芥進行耐旱性及根系形態評價, 探究Cre-miR171對植物響應干旱脅迫的影響． 并在轉基因柑橘中對預測的靶基因進行表達分析, 為深入研究Cre-miR171調控柑橘耐旱性的分子機理提供參考．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柑橘砧木品種枳(PoncirustrifoliataRaf.)、 扁平橘(CitrusdepressaHayata. ‘Shiikuwasha’)、 紅檸檬(C.limoniaOsbeck. ‘Canton Lemon’)的種子采自國家果樹種質柑橘圃(重慶, 北碚)． 本氏煙(Nicotianabenthamiana)、 擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子為本實驗室自繁．

DNA提取試劑盒(植物基因組DNA快速提取試劑盒), 反轉錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit), RNA提取試劑盒(天根DP504), 限制性內切酶(Thermo Fisher scientific), DNA Marker (Takara), 引物合成和測序由北京擎科生物科技有限公司完成．

1.2 試驗方法

將枳、 扁平橘和紅檸檬的種子去除種皮后于(28±1) ℃下保濕催芽． 挑選萌芽一致的種子播種于膨脹珍珠巖∶蛭石(體積比1∶1)的基質中, 在溫室(25±1) ℃中培養． 選取一月齡左右的不同砧木幼苗, 取其根、 莖、 葉用于Cre-miR171的組織表達分析． 分別于枳種子播種后30 d, 60 d和90 d, 取全根用于根的不同發育時期Cre-miR171的表達分析． 于枳種子播種后45 d, 取根尖和側根發生區樣品用于Cre-miR171在根不同部位的表達分析． 于枳種子播種后60 d, 取莖、 葉、 側根發生區以及根尖用于Cre-miR171靶基因的表達分析． 以上取樣各5株, 設5個生物學重復．

選取長勢一致的1月齡枳的水培幼苗, 分別用15%的PEG6000及100 μM的脫落酸(ABA)水溶液進行脅迫處理, 在處理的0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h分別采集全根作為樣品, 用于脅迫處理下Cre-miR171的表達分析． 選取播種后2個月、 長勢一致的盆栽枳幼苗于溫室內進行干旱處理, 在干旱處理的0 d, 5 d, 10 d, 15 d分別采集根尖區與側根發生區的組織樣品, 用于干旱脅迫下Cre-miR171的表達分析．

1.3 生物信息學分析

Cre-miR171的前體序列來自本實驗室前期構建的小RNA文庫． 利用Tbtools對Cre-miR171前體序列與從柑橘基因組數據庫下載得到的克里曼丁橘(C.clementina)基因組數據進行序列比對, 獲得Cre-miR171前體序列上游3 000 bp啟動子序列, 其順式作用元件通過PlantCARE(http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)進行預測分析． 利用psRNATarget: A Plant Small RNA Target Analysis Server (2017 Update) 在線網站psRNATarget(2017 update)軟件進行小RNA靶基因的互補配對, 以miRNA的5′端為種子序列與參考基因組克里曼丁橘的轉錄本3’UTR區對Cre-miR171的靶基因進行預測． 靶基因序列從在線網站Phytozome(https: //phytozome-next.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上獲取．

1.4 過表達Cre-miR171載體的構建及遺傳轉化

采用Primer 3在線軟件設計1對Cre-miR171前體序列的特異引物, 分別在序列的兩端加上SwaI,BamHI酶切位點(表1), 以枳的DNA為模板, 對Cre-miR171進行克隆． 用Solution I連接酶將Cre-miR171前體序列的全長與經SwaI,BamHI雙酶切后的PGBi載體進行連接, 轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中, 挑選單克隆送往北京擎科生物科技有限公司進行測序． 經測序驗證正確的過表達載體轉入農桿菌EHA105感受態細胞, 用枳上胚軸進行柑橘的遺傳轉化[14], 采用花序侵染法進行擬南芥的遺傳轉化[15]．

表1 Cre-miR171的核苷酸序列與引物序列

1.5 轉基因植株的鑒定與其靶基因的篩選

利用PCR方法對Cre-miR171的過表達柑橘植株和擬南芥植株進行鑒定． 正向引物是35S啟動子一段序列, 反向引物為Cre-miR171前體序列(表1), 以轉基因植株的DNA為模板進行擴增． 采用莖環法qRT-PCR檢測各轉基因柑橘植株的Cre-miR171相對表達量, 選擇Cre-miR171表達量最高的3株進行嫁接擴繁． 同時對其靶基因的表達進行定量分析．

1.6 煙草瞬時表達載體的構建與轉化

構建兩類煙草瞬時表達載體進行Cre-miR171與其靶基因的互作驗證． 一類為Cre-miR171前體序列超表達的GUS載體, 將Cre-miR171的前體序列與線性化的GUS載體連接; 另一類為改造過的超表達載體pMS4載體, pMS4載體在GFP基因前后有兩個酶切位點XhoI和XbaI, 經雙酶切之后用于插入miRNA靶基因位點． 靶基因位點是通過人工合成的兩條寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈, 分為SCclscl6,SCclscl22,SCclscl26以及經過改造的MTSCclscl6, MTSCclscl22, MTSCclscl26兩類(表2)． 重組后的質粒經北京擎科生物科技有限公司測序驗證正確后, 轉化至農桿菌GV3101菌株的感受態細胞, 在煙草中利用農桿菌介導的侵染共同表達miRNA及其靶基因．

表2 載體構建所用引物

1.7 Cre-miR171及其靶基因的熒光定量分析

莖環qRT-PCR和qRT-PCR分別被用來分析miRNA及其靶基因的相對表達量． miRNA的內參基因為U6, 靶基因的內參基因為柑橘CsActin． 用Primer5軟件設計miRNA的反轉錄引物和靶基因、 內參基因的實時熒光定量PCR引物(表3)． qRT-PCR反應體系為: 2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix 5 μL, 正、 反向引物各0.2 μL, RNase Free Water 2.6 μL, cDNA 2 μL(500 ng)． 擴增程序為: 95 ℃預變性10 min, 然后95 ℃ 15 s, 58 ℃ 60 s, 共設置40個循環． 所有的定量反應都在實時PCR System (Applied Biosystems 7 500 Fast, Applied Biosystems, USA)上完成． 每個qRT-PCR反應重復3次． miRNA及其靶基因的相對表達量采用2-ΔΔCT法進行計算[16]．

表3 qRT-PCR引物及序列

1.8 轉基因植株的耐旱性評價

選擇長勢一致的過表達Cre-miR171的擬南芥植株進行26 d的干旱處理, 并觀察其在干旱情況下的表型變化． 在處理14 d時取葉片樣, 測定POD與脯氨酸的含量．

選擇長勢一致的枳野生型和轉基因植株, 剪取相同生長部位的葉片, 放置在干燥的濾紙上, 測定脫水處理60 min內的質量變化, 計算相對失水率． 對脫水處理后的葉片進行電導率的測定, 計算處理后葉片的相對電導率．

剪取對照組和Cre-miR171表達量最高的過表達枳的枝條, 扦插于蛭石基質中, 待其長出根系后, 評價分析根的生長發育表現．

2 結果與分析

2.1 Cre-miR171前體上游調控區相關啟動子元件分析

利用PlantCARE對Cre-miR171前體上游啟動子順式作用元件進行預測(圖1), 結果發現: 該小RNA的啟動子區域除了含有典型的具有轉錄起始功能的TATA-box,CAAT-box核心元件外, 還包括激素和脅迫響應相關元件, 如脫落酸、 水楊酸和茉莉酸甲酯響應元件． 此外, 還包含一些光響應、 厭氧、 晝夜響應等相關元件． 根據以上結果, 推測Cre-miR171的表達受多種因素的誘導, 能參與逆境脅迫下的應答及調控．

圖1 Cre-miR171前體上游調控區相關啟動子元件

2.2 Cre-miR171在柑橘中的表達特征

在枳、 扁平橘、 紅檸檬的幼苗中對Cre-miR171的組織表達模式進行分析, 這3種砧木的耐旱性明顯不同, 其中枳的耐旱性最強[15]． Cre-miR171在3種不同砧木中表現出相同的組織表達特征, 在根中的表達量相對較低, 在莖中的表達量最高． 同時, Cre-miR171在耐旱性較強的枳的根和葉中的表達量顯著低于其他2種耐旱性比較弱的砧木, 與砧木的耐旱性相反, 說明Cre-miR171可能參與柑橘對干旱脅迫的響應． Cre-miR171在枳根生長發育的不同時期的表達也存在明顯差異, Cre-miR171在種子發芽后第30 d時表達極低, 在30～60 d時急劇上升, 在60～90 d時表達量無明顯變化, 表明Cre-miR171可能與根系的早期發育相關． Cre-miR171在根系的表達有一定的組織特異性, 在側根發生區的表達量明顯高于根尖(圖2), 說明Cre-miR171對側根發生和根伸長生長的作用存在差異．

不同小寫字母代表差異有統計學意義(p<0.05)．

2.3 Cre-miR171靶基因的預測、 鑒定和表達分析

利用psRNATarget對Cre-miR171的靶基因進行了預測, 通過生物信息學分析去除大量重復基因后, 發現Cre-miR171主要靶向9個靶基因, 分別為SCL家族基因Ciclev10019094m(SCL6),Ciclev10019083m(SCL22),Ciclev10000940m(SCL26); GRAS基因Ciclev10018916m、 酰基活化酶相關基因Ciclev10003943m、 蛋白磷酸酶相關基因Ciclev10001232m、 乙烯不敏感基因Ciclev10000617m以及2個功能未知基因Ciclev10010118m, Ciclev10027698m． 在嫁接成活的9株超表達Cre-miR171的枳植株中選取Cre-miR171表達量上調最高的OE-6,OE-8,OE-9等3個株系對靶基因的表達進行定量分析(圖3a), 發現Ciclev10019094m,Ciclev10019083m和Ciclev10000940m等3個靶基因的表達在超表達植株中受到了明顯的抑制, 說明這3個靶基因明顯受Cre-miR171的負調控, 靶向關系較強(圖3b)． 基因注釋和同源基因比較分析指出, 這3個基因是同屬于SCL家族的同源基因, 在本研究中將這3個基因分別命名為CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26． 這3個靶基因在枳中的表達表現出相同的組織特異性(圖3c), 和Cre-miR171的表達均呈明顯負相關, 進一步驗證了這3個基因是Cre-miR171的靶基因, 在功能上有明顯的相似性．

“**”代表相對于WT差異有統計學意義(p<0.01); 不同小寫字母代表差異有統計學意義(p<0.05)．

利用煙草瞬時表達試驗對Cre-miR171與CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26的相互作用進行了驗證(圖4)． 用農桿菌侵染煙草葉片, 分別共同表達Cre-miR171、 Cre-miRcontrol、 攜帶靶位點的GFP基因和攜帶修飾后的靶位點的GFP基因(圖4b)． 結果發現, 含有OE-miR171和OE-SCL26-GFP,OE-SCL6-GFP,OE-SCL22-GFP的農桿菌共同侵染煙草葉片后, 葉片中GFP熒光信號均發生了明顯的減弱, 而其他組合葉片中的GFP熒光信號沒有發生明顯的改變(圖4d)． 因此表明在植物體內, Cre-miR171能夠抑制靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達．

圖4 瞬時表達驗證Cre-miR171靶基因

2.4 非生物脅迫下Cre-miR171與靶基因在根中的表達分析

ABA處理下, Cre-miR171的表達在根中呈現出逐漸下降的趨勢, 但是變化幅度較小; PEG6000處理對Cre-miR171的表達影響非常顯著, 處理過程中, Cre-miR171在根中的表達呈現出先下降后快速上升再快速下降的趨勢, 表現出對脅迫處理的強烈響應, 說明Cre-miR171對滲透脅迫比較敏感(圖5a)． 為了了解干旱脅迫下Cre-miR171在根的不同部位的表達, 對枳幼苗進行了為期15 d的自然干旱處理． 在干旱處理的第10 d時, 觀察到側根開始發生(圖5c), 根尖數目增加, 而地上部分形態變化不明顯． Cre-miR171的表達明顯響應了干旱脅迫, 其在根尖中的表達量高于側根發生區, 特別在干旱處理10 d后更為顯著(圖5b), 3個靶基因的表達也顯示出了對干旱脅迫的明顯響應, 并在處理10 d后出現劇烈的變化(圖5d), 與Cre-miR171在這期間的表達明顯負相關． 從整個處理時期看, Cre-miR171與靶基因在干旱脅迫下根的兩個部位的表達均沒有達到顯著的相關性(表4), 特別在根尖的表達相關性更弱． 但在處理的第5 d后, Cre-miR171與其靶基因在根的兩個部位的表達趨勢均轉變為明顯的負相關(表5), 特別在10 d后均表現出強烈的變化, 說明Cre-miR171的表達受干旱脅迫的誘導, 并在響應脅迫后對靶基因產生了較強的調控作用． 另外, Cre-miR171在根部兩個部位的表達在處理的第10 d后出現相反的趨勢, 3個靶基因的表達也隨之發生相應的變化, 說明Cre-miR171在干旱脅迫下能抑制根的伸長生長, 促進側根的發生．

圖5 非生物脅迫下Cre-miR171與其靶基因在根中的表達

表4 干旱脅迫下Cre-miR171與其靶基因在根中表達水平的相關性分析

表5 干旱脅迫5～15 d內Cre-miR171與其靶基因在根中表達水平的相關性分析

2.5 表達外源Cre-miR171擬南芥的耐旱性評價

miR171在植物中較為保守[17], 序列比對顯示, Cre-miR171與擬南芥miR171家族成員之間只有2個核苷酸的差異(圖6a)． 對過表達Cre-miR171 3周齡的擬南芥進行26 d的干旱處理, 結果顯示, 在干旱14 d內, 野生型擬南芥的生長狀況良好, 葉片色澤鮮綠, 而轉基因植株的葉片顏色則明顯加深; 在干旱21 d時轉基因擬南芥葉片的邊緣枯黃, 野生型的擬南芥葉片的顏色也開始加深, 但轉基因擬南芥的葉片顏色更深, 而且轉基因擬南芥植株的生長已受到了極大的抑制, 植株明顯矮小; 干旱26 d時轉基因擬南芥的葉片因脫水而導致葉片大面積萎蔫(圖6c), 干旱脅迫處理對轉基因株系傷害程度明顯高于野生型株系． 以上結果說明, 過表達Cre-miR171使擬南芥對干旱逆境的敏感性顯著增加． 干旱處理14 d時轉基因植株的過氧化物酶含量高于野生型植株, 其脯氨酸含量也顯著高于野生型(圖6d), 也說明了轉基因擬南芥更早地響應干旱脅迫．

#1, #3, #5為不同轉基因擬南芥株系; ** 代表相對于WT差異有統計學意義(p<0.01)．

2.6 超表達Cre-miR171枳的耐旱性評價

對擴繁成活的轉基因植株OE-6,OE-8,OE-9的葉片進行脫水處理, 在處理30 min到60 min時轉基因株系葉片的相對失水率均顯著高于野生型． 轉基因枳的葉片在脫水處理后的電導率高于野生型(圖7), 說明轉基因枳膜系統被干旱損傷的程度高于野生型, 超表達Cre-miR171明顯降低了枳的耐旱能力．

* 表示相對于WT差異有統計學意義(p<0.05)．

對扦插生根的對照組和超表達Cre-miR171的枳植株的根系進行形態觀測(圖8a), 發現轉基因植株的側根比對照組的少, 根系也明顯短, 說明Cre-miR171影響了枳根系的生長發育, 超表達Cre-miR171抑制了枳的主根伸長生長和側根發生． 對扦插90 d的轉基因枳進行表達定量分析, 結果顯示, Cre-miR171在轉基因枳的葉片與根中的表達量都顯著上調(圖8b), 其靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達量受到抑制(圖8c), 說明Cre-miR171可能通過負調控其靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達來抑制主根的伸長生長和側根的發生．

** 表示相對于WT差異有統計學意義(p<0.01)．

3 結論與討論

在植物中, miR171參與調節植物基本的發育和代謝過程[18-19]． 在模式植物擬南芥中, miR171通過調控其靶基因AtSCL6-II,AtSCL6-III和AtSCL6-IV的表達影響莖尖分生組織[20-21]． 過表達miR171前體可以抑制腋芽形成和花芽數量, 從而改變擬南芥莖的結構[22]． 擬南芥幼苗在高鹽、 低溫和干旱脅迫下miR171的表達量都會上調[9], 推測miR171參與了擬南芥非生物脅迫的調控． 番茄中miR171和SCL6通過調節激素信號去調控番茄的生長發育[23]． 甘蔗中miR171響應鹽脅迫[24]．

Cre-miR171啟動子區有光信號、 脫落酸、 水楊酸、 茉莉酸甲酯等激素和脅迫響應元件, 同時miR171被證實響應光信號[25]、 茉莉酸甲酯[26]、 水楊酸、 脫落酸[27]誘導, 表明Cre-miR171可能受光信號、 茉莉酸甲酯、 水楊酸、 脫落酸等多條信號通路的影響, 推測Cre-miR171可能參與逆境脅迫下的應答及調控． 表達Cre-miR171的擬南芥對干旱脅迫更敏感, 脫水處理對過表達Cre-miR171枳葉片的膜系統的傷害顯著高于對照, 說明過表達Cre-miR171的枳轉基因植株的耐旱能力降低． 這與在蘋果中的研究結果相似[13], 表明Cre-miR171對柑橘的耐旱性有負調控的作用．

有研究表明miR171在根的發育和生長中發揮重要作用, miR171參與蘋果[28]和葡萄[29]的不定根形成, miR171還影響了水稻的根系發育[30], 同時miR171被證實可以影響蒺藜苜蓿的側根密度[31]． 本研究中, Cre-miR171在柑橘根發育的早期高表達, 而且在側根發生區的表達量高于根尖, 表明Cre-miR171對柑橘根系的發育及側根的形成有重要影響．

本研究中預測并驗證的3個Cre-miR171的靶基因(CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26)是植物中特有的轉錄因子, 其功能具有多樣性, 參與植物的生長發育[32]、 信號轉導、 生物脅迫和非生物脅迫相關的應答過程[33]． Cre-miR171在響應干旱脅迫后在側根發生區下調表達, 在根尖上調表達, 趨勢相反, 3個靶基因的表達也隨之發生相應的顯著變化, 說明在干旱脅迫下, Cre-miR171能通過對靶基因表達的調控抑制根的伸長生長, 促進側根的發生． 可以推測, Cre-miR171可能調控柑橘根系在干旱脅迫下的可塑性．