基于小RNA高通量測序檢測蕨麻病毒

田甜 李軍喬 王鑫慈 曲俊儒

摘要 本研究旨在對危害蕨麻的病毒種類進行探究，明確引起蕨麻病毒病的主要病原。以青海蕨麻2號品種和青海蕨麻4號品系為研究對象，分別編號為“PA-2”和“PA-4”，利用小RNA測序技術對其進行高通量測序，對測序結果進行處理和拼接后進行生信分析，鑒定出病毒種類。結果顯示，PA-2中共鑒定出9種病毒，其中懸鉤子黃網病毒和覆盆子葉斑駁病毒為主要病毒；PA-4中共鑒定出8種病毒，其中主要病毒為覆盆子葉斑駁病毒、玫瑰黃脈病毒和懸鉤子黃網病毒。經過候選病毒有效性檢測，PA-4BF和PA-4GR中均檢測出RLMV，分別比對到2 375 655條reads和1 838 987條reads，占小RNA的81.66%和82.08%，說明RLMV是侵染蕨麻的主要病毒。

關鍵詞 蕨麻；深度測序；病毒檢測

中圖分類號 S432.1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）09-0127-07

植物病毒對植物而言是毀滅性的存在，病毒寄生于植物體內，破壞植物葉綠素、物質代謝以及使植物激素紊亂，導致植物可能出現葉色黃化、生長緩慢以及矮化等癥狀，嚴重者使植物死亡。至今已報道的病毒種類大概有1 100多種[1]，病毒侵染植物速度快而且傳播途徑多，一旦在植物中流行，就會造成嚴重的損失。因此，對植物進行病毒檢測以預防病毒侵染在植物研究中顯得尤為重要。目前，病毒檢測手段已較為成熟[2-5]，小RNA深度測序在植物病毒檢測中也被廣泛應用[6]。小RNA深度測序鑒定病毒是利用植物寄主本身被病毒侵染時發生的RNA沉默反應產生的siRNA來鑒定病毒的存在以及通過序列比對確定病毒種類[7-8]。該方法省時、高效且不限制是DNA病毒還是RNA病毒，在植物病毒鑒定中發揮了巨大的作用[9-10]。

蕨麻（Potentilla anserina L.），俗稱“人參果”，是薔薇科鵝絨委陵菜屬的一個變種，與其主要的區別特征是蕨麻的塊根在高原地區可以膨大[11]。蕨麻內含豐富的營養物質，作為食品食用已有淵遠的歷史，在藥用方面，蕨麻可以對腫瘤病毒的復制產生抗性[12]，具有護肝和增強免疫力的功效，是優質的“藥食同源”的資源植物[13]。在西部高原地區，蕨麻種植產業是農牧民主要經濟來源之一，蕨麻市場價為200～400 元/kg，經濟效益較高。蕨麻在生態環境上可起到修繕土壤、防沙固土的作用，蕨麻根系和匍匐莖發達，耐旱、耐寒、克隆性強，生長速度快，因此在固土、涵養水源等方面能夠發揮作用[11]。2021年8—10月，筆者在青海湟源縣日月藏族鄉蕨麻種質資源圃中采挖蕨麻時發現，蕨麻地上部分葉片出現皺縮、黃化、畸形以及部分壞死，地下塊根部分出現畸形、變小以及色澤變差等疑似病毒病侵染的癥狀，有些蕨麻品種雖然葉片沒有表現出癥狀，但地下塊根有畸形、變小的表現，導致市場價值受到影響。研究發現，植物受到病毒侵染后，其內含成分會受到影響，或降低其主要有效成分[14]，從而影響蕨麻口感。蕨麻病毒病的研究目前相對較少，是一個非常值得挖掘研究的領域，基于在種植基地的觀察，初步判斷蕨麻的異常癥狀是由病毒侵染造成。為此，本試驗采用小RNA深度測序對蕨麻進行病毒測序和鑒定，以明確蕨麻中的病毒種類，為后續病毒病的預防和研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年9月17日，于青海省湟源日月藏族鄉蕨麻種質資源圃采集疑似感病蕨麻，地上部分表現為脈黃、畸形以及皺縮，地下塊根變小、畸形等癥狀（圖1）。以青海蕨麻2號品種和青海蕨麻4號品系為研究材料，摘取葉片后，液氮快速冷凍，后帶回實驗室后存貯于-80 ℃冰箱中保存備用。將青海蕨麻2號樣品編號為PA-2，青海蕨麻4號品系樣品編號為PA-4。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理及小RNA測序。采用TRlzol試劑提取樣品總RNA，經檢測合格后，送至北京百邁客生物科技有限公司，委托其進行文庫構建和小RNA深度測序。

1.2.2 原始數據過濾及18～30 nt小RNA篩選。對測序得到的原始數據進行篩選過濾，即將含有接頭的序列以及低質量序列過濾掉。當植物被病毒侵染后，體內合成的小RNA主要長度在19～24 nt[8]。為了更高效率篩選出合適的序列，先將原始數據中18～30 nt的小RNA序列篩選出來得到clean reads，再將clean reads進行后續分析。

1.2.3 樣品候選病毒分析。將篩選出的clean reads序列進行注釋，去除掉能夠與非編碼數據庫比對上的序列，剩余未知序列使用velvet進行序列拼接，拼接后得到較長的重疊群（contigs），與NCBI NT（NCBI non-redundant nucleotide sequences）數據庫進行比對，得到高度同源序列，將沒有比對到的數據與NCBI NR（NCBI non-redundant protein sequences）數據庫比對，得到部分同源序列，后將在2個數據庫中都比對到的序列，在GenBank Virus RefSeq核酸數據庫（簡單表示為“Virus RefSeq Nucletide”），GenBank Virus RefSeq蛋白數據庫（簡單表示為“Virus RefSeq Protein”）進行比對，得到與病毒同源的contings，根據其相似度和contigs比對數，初步評估為候選病毒。

2 結果與分析

2.1 RNA提取質量檢測

使用Nanodrop和Agileng 2100對提取的蕨麻樣品RNA進行質量檢測，結果顯示，樣品PA-2和PA-4的RNA質量滿足試驗要求（RIN≥7，且28S/18S≥1.8）（表1）。

2.2 小RNA測序數據統計

質檢合格的樣本通過Small RNA測序后，樣品PA-2中獲得27 492 685條Raw Reads和25 068 078條有效reads（Clean reads），占Raw reads的91.18%；樣品PA-4中獲得29 769 472條Raw Reads和25 356 893條有效reads（Clean reads），占Raw reads 的85.18%（表2）。兩者皆可用于后續生物信息學分析。

2.3 18-30 nt小RNA的條數

由表3可知，在采集到的2個樣品PA-2和PA-4中，分別篩選到18～30 nt的小RNA數量為184 840條和219 614條，其中，22 nt、21 nt在樣品中占比最高，在PA-2和PA-4中分別為21.32%、17.99%和19.06%、17.57%。主要以21 nt、22 nt數量最多（圖2）。

2.4 小RNA的拼接與注釋

利用Bowtie[15]軟件，將Clean Reads分別與Silva數據庫[16]、GtRNAdb數據庫[17]、Rfam數據庫[18]和Repbase數據庫[19]進行序列比對，對小RNA進行分類注釋。由表4可知，rRNA所占比例分別為35.30%（PA-2）和34.00%（PA-4），說明RNA沒有降解，在植物樣品中是質量較好的rRNA，文庫構建合格[20]。2個樣品中未知序列的占比都超過了60%，這可能與缺少蕨麻的全基因組有關。其他小RNA種類占比都較少，除tRNA最高（3.75%）外，其他都在3.00%以下。

在PA-2和PA-4中分別獲得3 471、1 981條contigs，其中，PA-4在病毒核酸數據庫中注釋到2條contigs，PA-2中沒有注釋到；在病毒蛋白數據庫中分別注釋到92條和136條contigs（表5）。

2.5 候選病毒

由表6可知，PA-2中比對鑒定到9種病毒，其中，與懸鉤子黃網病毒（Rubus yellow net virus，RYNV）同源的contigs最多，有36條；其次是覆盆子葉斑駁病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）和原綠球菌噬菌體P-TIM68病毒（Prochlorococcus phage P-TIM68），分別為20、18條；其他病毒比對結果均為10條以下。PA-4中共比對鑒定到8種病毒，懸鉤子黃網病毒比對到的同源的contigs最多，有15條，其次是覆盆子葉斑駁病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）、番茄黃色斑駁相關病毒（Tomato yellow mottle-associated virus，TYMAV）以及玫瑰黃脈病毒（Rose yellow vein virus，RYVV），分別為13、12和11條，其他病毒比對到的同源的contigs較少，均在10條以下。

通過對蕨麻樣品的候選病毒的初步篩選，PA-2F中鑒定到的RYNV和RLMV可能是其主要病毒。PA-4中主要病毒可能為RLMV、RYVV、RYNV以及TYMAV。對候選病毒進行有效性評估、鑒定發現（表7），RLMV在PA-2和PA-4中比對到的reads分別有2 375 655條和1 838 987條，占總參考序列的81.66%和82.08%，說明候選病毒有效，2種樣品中均包含的主要病毒為RLMV。

3 結論與討論

深度測序技術是目前植物病毒學研究的熱點工具，因其高靈敏度和樣品量少且快速檢測的特點而廣泛被應用[21]。本研究中，通過小RNA深度測序研究發現，小RNA長度集中于21～24 nt，小RNA的長度基本在此范圍內[8]，結果可靠。后續分析發現，采集的樣品中PA-2和PA-4分別檢測到9種、8種病毒，經過候選病毒有效性檢測可知，2個樣品中均含有RLMV，比對到的reads分別有2 375 655條和1 838 987條，占比分別為81.66%、82.08%。其他病毒比對到的重疊群條數雖然多，但和有效性不成正比，說明蕨麻中可能含有多種復合病毒，但主要病毒為RLMV。

RLMV是新發現的一種暫定為closterovirus屬的病毒[22]，在樹莓中可以造成脆果、果實變小等嚴重影響，目前尚未在國內有過報道，而在波蘭、波斯尼亞、美國等國家均有報道[23-25]，這與不同國家種植得主要產物不同有關。本研究中，通過序列比對和候選病毒有效性分析在蕨麻中發現了RLMV，是國內的首次相關報道。

蕨麻作為青藏高原特有植物資源，其在藥用成分、食用營養成分以及生態價值等方面均有研究，是一種優良的植物資源[26-27]。觀察發現，植物葉片出現皺縮、黃化、畸形，塊根變小、畸形等疑似病毒感染癥狀。為探究原因，課題組在土壤成分變化、真菌細菌感染以及根腐病等方面做了研究，而在病毒上的研究尚未涉及，目前仍處于空白領域。調查同科植物病毒發現，薔薇科植物中已研究的病毒種類較多，如在果樹中的草莓[28]、樹莓[29]、梨[30]、桃[31]，花卉中的玫瑰、月季[32]等都已有研究。RLMV在薔薇科植物中已有研究，Miros?awa[24]對RLMV研究表明，其會造成樹莓果實易碎、植物生長緩慢以及果實減少等影響，Diego等[25]同樣在樹莓中發現有RLMV，導致葉脈變黃，嚴重時導致植株死亡，在果實收獲時，使果實變得易碎，從而影響產量和品質。本試驗中，2個樣品中都檢測到RLMV，說明該病毒在蕨麻中已有一定的傳播范圍，蕨麻塊根大小的變化以及畸形在很大程度上都與其有關。蕨麻在種植過程中，基本以塊根無性繁殖進行播種，連作的耕田制度可能使土壤的營養成分發生變化[33]，蕨麻生長受到一定影響，再加上秋冬季節采挖時不能完全將土里的蕨麻塊根采挖干凈，使得部分蕨麻多年連續繁殖，給病毒的積累提供了條件，使得多種病毒復合侵染，積累在蕨麻中。病毒侵染造成蕨麻地上部分出現黃化、皺縮和壞死的癥狀，使得地上部分生物量減少，在秋季蕨麻地下塊根膨大時，地上部分無法完全轉化成營養提供給塊根[34]，影響塊根的膨大，造成塊根畸形、變小，從而使經濟價值下降。

研究發現，通過序列比對得到的病毒除了RLMV外，還包括RYNV和RYVV等，這些病毒在薔薇科植物中均有研究和報道，也是同科主要病毒的組成部分[32]，這進一步說明測序結果可靠。研究還發現，病毒浸染植物并不總是單一侵染，大部分以復合侵染為主。病毒的復合侵染在植物中非常普遍，張永鵬等[35]對青海部分地區馬鈴薯病毒檢測中發現，有2種病毒侵染的樣品占檢測樣品的7.73%；楊小龍[36]對福建福清地區的馬鈴薯病毒檢測中發現，同一植株有達3種病毒同時侵染；楊波[37]對新疆草莓研究中發現，有2種病毒復合侵染的比例達16.67%。本研究對蕨麻病毒檢測中得到的病毒種類較多，樣本雖為3個品種和品系的混合樣，但不排除有復合侵染的可能，病毒的復合侵染可能造成蕨麻形態的多樣變化以及地下部分的不同癥狀表現，共同作用而使得蕨麻形變，進一步對生態價值、經濟價值以及藥用和食用價值產生影響。盡早地發現病毒病原可以有效防預，減少損失，因此可在后續試驗中對蕨麻病毒復合侵染情況做相關研究，更可以在不同品種中研究病毒的侵染情況，做到早發現、早防預。

病毒鑒定方法是發現植物病毒最重要的一環，盡管小RNA深度測序為植物病毒的檢測提供了良好的平臺，但大量的數據和小片段的拼接以及拼接使用的軟件的不同會對拼接結果產生一定的影響[8]。再加上拼接的結果并不能完全是病毒的完整基因組，比對的片段有長有短，比對的一致性高低不一，還需要通過有效性檢測，或通過PCR驗證來初步確認病毒種類[38，39]。本研究中，RYNV在2個樣品中均有最多條序列能與之比對，但其有效性卻都不高。研究中還發現有Prochlorococcus phage P-TIM68，這可能與采樣時未完全清除樣品表面上的雜質有關。樣品的采集和制備在小RNA病毒檢測測序中也是非常重要的一環，RNA容易降解且制備過程中易污染，因而需要格外注意RNA的質量[21，40]

蕨麻作為青藏高原地區特色植物，在多方面均已有研究，而對近年來出現疑似感病癥狀的研究相對較少，因此，從病毒學角度來探究引起蕨麻癥狀的原因以及找出病原是目前較為迫切的研究。植物病毒繁殖快、變異率高、分布和傳播途徑都較廣泛，而目前對植物病毒的防預主要采用早發現、早防預的對策，加之缺少有效的防治藥劑使得病毒成為生產上的難題[41-42]，因此，盡早發現病毒可以有效對植物進行早期預警和綜合防治，減少損失。在后續研究中，可將研究方向集中于對得到的病毒種類設計引物進一步驗證病毒的存在以及明確病毒的侵染性強弱、病毒的侵染是否為大范圍的暴發、病毒的侵染是否會對蕨麻的藥用成分、食用成分和生態價值造成影響以及有什么樣的影響等。

參考文獻

[1] 邱并生，王敏. 植物病毒學的研究進展[J].中國病毒學，2004（3）：106.

[2] 宋瑜. 三種侵染木本植物的病毒鑒定[D].杭州：浙江大學，2021.

[3] 董芳娟，魏增云，薄一覽. 分子生物學技術在植物病毒檢測中的應用[J].農業與技術，2021，41（11）：23.

[4] 薛超. 植物病毒檢測技術研究進展分析[J].農業與技術，2020，40（16）：48.

[5] 張偉，徐碩，陳德鑫.常用植物病毒病檢測技術比較[J].南方農業，2013，7（12）：26.

[6] 蘇秀. 小RNA深度測序在幾種木本植物病毒鑒定中的應用[D].杭州：浙江大學，2015.

[7] ZHU H，GUO HS. The role of virus-derived small interfering RNAs in RNA silencing in plants[J].Science China.Life Science，2012，55（2）：119.

[8] 陳莎. 深度測序鑒定玉米病毒及感病玉米組織中小RNA分析[D].杭州：浙江大學，2015.

[9] EUGANG L，SHAN G，ALVARO G，et al. Deep sequencing of small RNAs in tomato for virus and viroid identification and strain differentiation[J].PloS One，2012，7（5）：e37127.

[10] 趙娜，苗艷梅，趙敏. 未知植物病毒分子生物學檢測方法的研究現狀[J].江蘇農業學報，2019，35（1）：226.

[11] 李軍喬，蔡光明，李靈芝. 中國蕨麻[M]. 北京：科學出版社，2020.

[12] 劉素君，李世元，宋九華，等. 鵝絨委陵菜多糖抗腫瘤作用研究[J].中國現代應用藥學，2011，28（3）：185.

[13] 郭杰，王吉鴻，賈國軍，等. 蕨麻化學成分及藥理活性研究[J].現代鹽化工，2022，49（3）：37.

[14] 謝聯輝，林奇英. 植物病毒學[M].北京： 中國農業出版社，2004.

[15] LANGMEAD B，TRAPNELLl C，POP M，et al. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome[J]. Genome Biology，2009，10（3）：25.

[16] PRUESSE E，QUAST C，KNITTEL K，et al. SILVA：a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J]. Nucleic Acids Research，2007，35（21）：7188.

[17] CHAN P P，LOWE T M. GtRNAdb：a database of transfer RNA genes detected in genomic sequence[J].Nucleic Acids Research，2009，37（1）：93.

[18] GRIFFITHS J S，BATEMAN A，MARSHALL M，et al. Rfam：an RNA family database[J].Nucleic Acids Research，2003，31（1）：439.

[19] JURKA J，KAPITONOV V V，PAVLICEK A，et al. Repbase update，a database of eukaryotic repetitive elements[J]. Cytogenetic and Genome Research，2005，110（4）：462.

[20] 謝雪花. 小RNA深度測序鑒定草莓病毒的研究及草莓快繁體系的優化[D].長沙：湖南農業大學，2016.

[21] 劉青，周書玉，崔冬麗. 高通量測序技術在植物病毒分類中的應用[J].西南大學學報（自然科學版），2022，44（7）：87.

[22] MCGAVIN W，MACFARLANE S. Sequence similarities between Raspberry leaf mottle virus，Raspberry leaf spot virus and the closterovirus Raspberry mottle virus[J]. Annals of Applied Biology，2010，156（3）：439-448.

[23] THEKKE-V，KHADGI A，JOHNSON D，et al. First report of Raspberry leaf mottle virus in blackberry in the United States[J]. Plant Disease，2017，101（1）：5.

[24] MIROSLAWA C. First report of raspberry leaf mottle virus infecting raspberry in Poland[J]. Plant Disease，2021，105（3）：714.

[25] DIEGO F，QUITO A. Effect of Raspberry bushy dwarf virus，Raspberry leaf mottle virus，and Raspberry latent virus on plant growth and fruit crumbliness in ‘Meeker red raspberry[J]. Plant Disease，2014，98（2）：176.

[26] 李晨芹，李軍喬，王鑫慈，等. 蕨麻根腐病病原菌的分離鑒定及其生物學特性研究[J].草業學報，2022，31（4）：113.

[27] 郭杰，王吉鴻，賈國軍，等. 蕨麻化學成分及藥理活性研究[J].現代鹽化工，2022，49（3）：37.

[28] 何成勇，高德航，范靈姣，等. 利用小RNA深度測序快速鑒定草莓病毒[J].中國農業大學學報，2021，26（8）：54.

[29] SVETLANA A，PAUNOVIC，DARKO J. The first detection of raspberry leaf mottle virus in Serbia[J]. Journal of Plant Pathology，2020，102（3）：102.

[30] 楊潔萍. 基于轉錄組與小RNA測序的庫爾勒香梨病毒檢測[D].石河子：石河子大學，2020.

[31] 周俊. 桃及其野生近緣種中病毒組研究[D].北京：中國農業科學院，2020.

[32] 王沖. 薔薇科植物病毒研究[D].杭州：浙江大學，2005.

[33] 王雅瓊，李軍喬，白世俊，等. 不同種植年限蕨麻根際土壤養分變化規律[J].貴州師范大學學報（自然科學版），2020，38（4）：56.

[34] 張錦，沈寧東，韋梅琴，等. 蕨麻生長過程中源和庫的形成及相互關系[J].青海大學學報（自然科學版），2016，34（4）：86.

[35] 張永鵬，楊鈺澤，咸文榮，等. 青海省部分地區馬鈴薯病毒種類與Y病毒株系類型研究[J].西南農業學報，2022，35（8）：1818.

[36] 楊小龍. 福建福清地區馬鈴薯病毒病的病原檢測及分子鑒定[D].福州：福建農林大學，2018.

[37] 楊波. 新疆草莓病毒病檢測及脫毒繁育體系建立[D].石河子：石河子大學，2018.

[38] 王明星，陳巧環，許佳偉，等. 基于小RNA深度測序鑒定湖北省荊半夏病毒病主要病原[J/OL].中藥材，2022（11）：2535. DOI：10.13863/j.issn1001-4454.2022.11.001.

[39] 湯亞飛，裴凡，李正剛，等. 基于小RNA深度測序技術鑒定侵染廣東辣椒的病毒種類[J].中國農業科學，2019，52（13）：2256.

[40] 劉杰，于成明，陳芳龍，等. 提取櫻桃中植物病毒RNA方法的建立與優化[J].山東農業大學學報（自然科學版），2021，52（6）：922.

[41] 辛敏. 高通量測序鑒定西瓜新病毒[D]. 北京：中國農業科學院，2017.

[42] HULL R. Plant virology （Fifth Edition）[M]. San Diego：Academic Press，2014. （責編：張宏民）

基金項目 青海省重點研發與轉化計劃（2022-NK-120）和青海民族大學2021年研究生創新項目（54M2021005）。

作者簡介 田甜（1997—），女，貴州銅仁人，在讀碩士。研究方向：藥用植物資源學。