miR-146a調控JNK信號通路對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

孫偉 何萌萌 邵春芝 宋云超

在臨床治療過程中,大量難治性低氧血癥危重患者需要高氧治療,但是,長期暴露于高水平的氧氣會導致急性肺損傷,并可能導致新生兒支氣管肺發育不全和成人急性呼吸窘迫綜合征[1]。在高氧誘導的急性肺損傷中,高氧可導致肺泡上皮細胞凋亡和壞死[2]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一種由18～22個核苷酸組成的小型非編碼RNA,在全身組織和器官中廣泛表達。miRNA參與細胞生長、增殖、分化、凋亡、代謝和其他生物過程。根據報道,miR-146a在過氧化氫刺激的Ⅱ型肺泡上皮細胞中低表達,同時檢測到細胞凋亡的增加[3]。miR-146a可以減輕煙霧刺激的小鼠炎性反應,調節吸入性肺損傷進程[4]。這些結果提示,miR-146a對肺損傷具有一定的保護作用,但其機制尚未完全明了。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路是高氧肺損傷中的關鍵傳導途徑[5],此外,JNK也是miR-146a的下游靶點之一[6]?；诖?本研究探討miR-146a、JNK信號通路與高氧誘導的肺泡上皮細胞氧化應激和凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 肺泡上皮細胞A549購自美國典型培養物保藏中心,Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養基購自美國Gibco,miR-146a mimic購自廣州RiboBio公司,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、錳(Mn)SOD檢測試劑盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成公司,膜聯蛋白(Annexin V)V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基公司,miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA RT-PCR試劑盒購自北京天根公司。

1.2 細胞培養與實驗分組 肺泡上皮細胞A549在RPMI-1640培養基(10%胎牛血清)中培養,生長環境為37℃、5% CO2。當肺泡上皮細胞處于對數生長期時,將其分為Con(對照)組、Model(模型)組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組、Model+miR-146a+Anisomycin組。其中,Model組高氧處理時,培養箱中通入高純混合氣體(3 L/min),包含O2(900 ml/L)和CO2(50 ml/L)[7],保持10 min,之后密閉培養。Model+miR-NC組、Model+miR-146a組分別將miR-NC、miR-146a mimic通過Lipofectamine 2000轉染試劑轉染至肺泡上皮細胞,24 h后進行高氧處理。Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細胞轉染miR-146a mimic并加入10 μmol/L JNK信號通路激活劑Anisomycin,24 h后進行行高氧處理。

1.3 試劑盒檢測SOD、MnSOD活性和MDA含量 收集各組肺泡上皮細胞A549上清液,遵循SOD、MnSOD和MDA檢測試劑盒的操作步驟,檢測氧化應激指標SOD、MnSOD活性和MDA含量。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙重染色法評估細胞凋亡 收集肺泡上皮細胞A549,經磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中洗滌2次,然后重新懸浮在結合緩沖液中。然后將AnnexinV-FITC和PI添加到樣品中。在室溫下于黑暗中孵育15 min,再次用結合緩沖液稀釋樣品,并在1 h內通過流式細胞儀分析凋亡細胞的百分比。測量Annexin V+/PI-(早期凋亡)和Annexin V+/PI+(晚期凋亡)凋亡細胞之和。

1.5 蛋白質印跡法(Western blot)分析活化的(Cleaved)-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)、pro-caspase3、磷酸化JNK(p-JNK)表達 肺泡上皮細胞A549用冰冷的PBS洗滌2次,在冰冷的RIPA緩沖液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物,在使用前加入)中裂解10 min。將細胞裂解物在4℃下以12 000 r/min離心10 min,并收集上清液。用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白測定試劑盒測定上清液的蛋白含量。將蛋白樣品的等分試樣(30 μg)在12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上分級分離,并印跡到PVDF膜。在室溫下用5%(w/v)的脫脂奶粉在PBS中封閉1 h后,用特異的一抗在4℃下過夜探測膜。然后將膜洗滌3次,并在室溫下暴露于辣根過氧化物酶偶聯的二抗2 h。再次清洗膜3次后,用增強的化學發光(ECL)檢測系統觀察抗原-抗體條帶。所用一抗為艾博抗公司的Cleaved-caspase3(1∶1 000稀釋)、pro-caspase3(1∶1 000稀釋)、p-JNK(1∶1 000稀釋)和對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：1 000稀釋)抗體。

1.6 逆轉錄定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測miR-146a表達 使用TRIzol試劑從肺泡上皮細胞中提取總RNA。RNA的濃度和質量使用Nanodrop ND2000紫外分光光度法進行測量。隨后,通過RT從1 μg RNA中獲得cDNA,并保存在-20℃下。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行miRNA的RT。U6作為內部參照,使用miRNA RT-PCR試劑盒測定miR-146a的表達。使用的引物序列如下：miR-146a 5’-CGGCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’(正向)和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(反向);U6 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反應方案包括在95℃初始變性5 min,然后95℃變性10 s,在60℃退火20 s和在72℃延伸10 s(40 cycles)。使用2-ΔΔCt方法計算miR-146a對U6的相對表達。

2 結果

2.1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組肺泡上皮細胞中SOD和MnSOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);與Model組或Model+miR-NC組相比,Model+miR-146a組肺泡上皮細胞中SOD和MnSOD活性升高,MDA含量減少,差異有統計學意義(P<0.05);而Model組與Model+miR-NC組肺泡上皮細胞中SOD、MnSOD活性和MDA含量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激的影響 n=3,

2.2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組肺泡上皮細胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平提高,pro-caspase3蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05);與Model組或Model+miR-NC組相比,Model+miR-146a組肺泡上皮細胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平降低,pro-caspase3蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);而Model組與Model+miR-NC組2組肺泡上皮細胞的凋亡率、Cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1,表2。

圖1 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡及caspase3蛋白表達的影響;A Western blot檢測miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞caspase3蛋白表達的影響;B 流式細胞術檢測miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡的影響

表2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡的影響 n=3,

2.3 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞中JNK信號通路的影響 與Con組相比,Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-146a組降低肺泡上皮細胞內miR-146a的表達水平,而提高p-JNK蛋白表達水平,差異有統計學意義(P<0.05);Model+miR-146a組肺泡上皮細胞的miR-146a表達水平高于Model組或Model+miR-NC組,p-JNK蛋白表達水平低于Model組或Model+miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05);Model組與Model+miR-NC組肺泡上皮細胞中miR-146a、p-JNK蛋白的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2,表3。

圖2 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞中JNK信號通路的影響

表3 miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞中JNK信號通路的影響 n=3,

2.4 JNK信號通路激活劑能逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激的影響 與Model+miR-146a組相比,Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細胞的SOD、MnSOD活性降低,MDA含量升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 Anisomycin逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激的影響 n=3,

2.5 JNK信號通路激活劑能逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡的影響 與Model+miR-146a組相比,Model+miR-146a+Anisomycin組肺泡上皮細胞的凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平升高,pro-caspase3蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 Anisomycin逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡及caspase3蛋白表達的影響;A 流式細胞術檢測肺泡上皮細胞凋亡的影響;B Western blot檢測肺泡上皮細胞caspase3蛋白表達的影響

表5 Anisomycin逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞凋亡的影響 n=3,

3 討論

高氧引起的急性肺損傷是最難治的疾病之一,迄今為止,其具體機制尚未完全了解。肺泡上皮細胞是高氧的主要靶細胞,其凋亡被認為是高氧誘導的急性肺損傷發病機制的潛在機制[8]。已有報道,抑制肺泡上皮細胞的細胞凋亡可有效降低高氧誘導的大鼠急性肺損傷[9]。因此,肺泡上皮細胞凋亡是高氧誘導的急性肺損傷的關鍵因素。氧化應激在急性肺損傷的機制中起重要作用。高氧損傷會造成氧化應激,它優先氧化細胞中的心磷脂和其他類型的脂質,這一事件導致細胞凋亡。高氧誘導的肺損傷,尤其是嚴重的肺上皮細胞死亡,擾亂了肺的正常修復過程,并在浸潤性免疫細胞極少參與的情況下促進了纖維化反應[10]。本研究將肺泡上皮細胞暴露于高氧中,發現MDA水平升高,SOD活性降低[11],細胞凋亡增加[12],證實了高氧肺損傷模型的有效建立。

miR-146a被報道與多種病理狀況有關,包括腫瘤發展[13,14]、類風濕性關節炎[15]、肺[16]、腎[17]、肝[18]和心血管[19]等疾病。研究表明,miR-146a在大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷中呈低表達,miR-146a介導遠端缺血后處理保護肢體缺血再灌注后引起的肺損傷的機制[20]。與健康受試者相比,百草枯中毒引起的肺損傷患者中miR-146a的表達顯著降低。模擬轉染過表達miR-146a下調了肺巨噬細胞中白介素-6的表達,調節百草枯中毒引起的肺損傷的發生和免疫反應[21]。在博來霉素構建的肺纖維化模型中,小鼠組織中的miR-146a表達降低,miR-146a過表達時轉化生長因子β1引起的肺成纖維細胞凋亡被抑制[22]。糖尿病腎病大鼠血清miR-146a低表達,與糖尿病腎病模型中MDA含量呈負相關、SOD活性呈正相關[23]。本研究發現,高氧下肺泡上皮細胞miR-146a的表達水平降低,與前人研究[20]一致。過表達miR-146a后,高氧誘導的肺泡上皮細胞SOD、MnSOD活性、pro-caspase3蛋白水平顯著升高,MDA含量、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著降低,說明miR-146a可以有效減輕高氧誘導的肺泡上皮細胞氧化應激,抑制其凋亡,從而保護肺泡上皮細胞免受高氧損傷。

許多研究報道JNK信號通路與高氧下的肺損傷有關。例如,暴露于高氧的新生大鼠肺損傷模型檢測到p-JNK、JNK蛋白表達的升高[24],JNK信號通路被激活,并促進高氧下肺損傷細胞的凋亡[25],本研究觀察到相同的結果。此外,miR-146a能夠降低高氧下肺泡上皮細胞中p-JNK蛋白表達水平,提示miR-146a發揮保護作用的機制與JNK信號通路有關。此前已有報道指出,miR-146a通過JNK和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路模擬改善創傷性腦損傷[26]。雷公藤紅素可以減輕脂多糖誘導的炎癥損傷,并通過上調miR-146a使JNK和NF-κB通路失活[27]。長鏈非編碼RNA SNHG16通過競爭性結合miR-146a-5p和CCL5進一步介導JNK和NF-κB途徑,調節脂多糖誘導的人肺成纖維細胞WI-38炎癥損傷[28]。本實驗中,miR-146a抑制JNK信號通路活性,JNK信號通路激活劑Anisomycin能逆轉miR-146a對高氧下肺泡上皮細胞氧化應激和細胞凋亡的抑制作用。這些結果表明,miR-146a通過抑制JNK信號通路從而改善高氧下肺泡上皮細胞損傷。

綜上所述,miR-146a在高氧下肺泡上皮細胞中低表達,其過表達可以減輕高氧誘導的肺泡上皮細胞氧化應激和細胞凋亡,作用機制與抑制JNK信號通路活性有關,提示miR-146a可能成為肺損傷中基于miRNA療法的潛在治療靶點。