肝硬化食管胃底靜脈曲張患者口腔和腸道菌群變化

任海霞 平付敏 牛淑利 郭永澤 李淑霞 王建華 郭曉會(huì) 閆華楠 王恩雨 葉東

肝硬化是多種慢性肝病引起肝損傷的共同病理途徑,包括肝細(xì)胞變性、壞死、肝實(shí)質(zhì)被纖維化組織和再生結(jié)節(jié)替代、肝功能喪失等[1],患者晚期出現(xiàn)肝功能衰竭、門靜脈高壓和多種并發(fā)癥。從21世紀(jì)開始,科學(xué)界依據(jù)消化管道與肝臟的天然解剖關(guān)系,提出了口腔-腸-肝軸理論,揭示了肝臟疾病與口腔和腸道菌群之間的關(guān)系。16S rRNA長(zhǎng)度約1.5 kb,信息量較大且易于分析,可以體現(xiàn)出細(xì)菌菌屬的序列及差異[2]。本研究通過16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析健康人群和肝硬化食管胃底靜脈曲張(CEGV)患者口腔和腸道菌群的不同,探討口腔和腸道菌群的組成和聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究實(shí)驗(yàn)組(CEGV組)收集2020年6月至2021年8月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院、邯鄲市傳染病醫(yī)院收治的經(jīng)臨床、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室、內(nèi)鏡等檢查手段確診為CEGV的患者(肝硬化食管胃底靜脈曲張?jiān)\斷參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《肝硬化診治指南》)[3],收集同時(shí)期的健康志愿者作為對(duì)照組(HC組)。(1)HC組：入選標(biāo)準(zhǔn)：①家族中無(wú)肝病患者及與納入患者無(wú)血緣關(guān)系;②既往無(wú)消化系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等病史;③近期無(wú)上呼吸道感染,無(wú)口腔疾病及牙齦出血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胃腸道手術(shù)史;② 1個(gè)月內(nèi)使用過抗生素或益生菌。(2)CEGV組：入選標(biāo)準(zhǔn)：①肝硬化病因不限且臨床資料完整;②可合并腹水。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴其他系統(tǒng)重大疾病及惡性腫瘤;②有牙科病史和口腔檢查發(fā)現(xiàn)任何有活動(dòng)性牙齦或牙周病;③合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等可引起腸道菌群紊亂的患者;④有胃腸道手術(shù)史者;⑤ 1個(gè)月內(nèi)使用過抗生素及益生菌。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)本研究均知情同意,本研究獲得河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核同意。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 唾液采集：所有研究對(duì)象至少在標(biāo)本收集2 h前不進(jìn)食,不飲水、不刷牙。收集過程中,受試者手拿無(wú)菌、無(wú)酶收集管,口含唾液≥1 min,隨后使唾液2～5 ml流入試管中,2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室-86℃冰箱保存。

1.2.2 糞便采集：用糞便取樣器留取糞便中段里部50～100 mg樣本,每樣留存2～3管備份,2 h內(nèi)放入-86℃超低溫冰箱保存,采集管要求無(wú)菌、密封,采集過程中避免尿液等污染。

1.3 DNA提取、16S rRNA基因文庫(kù)制備、信息分析 將唾液和糞便樣本放入裂解液中裂解離心得到樣品DNA(起始量≥30 ng,質(zhì)量要求：無(wú)色素等雜質(zhì);無(wú)降解或輕微降解;體積,容積：15 ～100 μl;濃度：6～100 ng/μl),檢測(cè)NanoDrop樣品濃度和1%瓊脂糖凝膠樣品完整性。取唾液或糞便樣品與融合擴(kuò)增引物(PCR引物使用細(xì)菌16S rDNA的 V3～V4區(qū)特異性引物341F和806R)配置 PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增;待擴(kuò)增結(jié)束后,用Agencourt AMPure XP 磁珠進(jìn)行純化,溶于 Elution Buffer內(nèi),文庫(kù)構(gòu)建完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器進(jìn)行檢測(cè)文庫(kù)片段的濃度和總量片段大小。檢測(cè)合格的樣本pooling后,以Illumina Hiseq 2500 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序類型為PE300,得到的Raw data經(jīng)過過濾獲得Clean data。通過reads間的互相重疊關(guān)系將reads拼接成Tags,聚類成OTU并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、物種注釋;基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種分析,組間物種多樣性和差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象基本情況 選取經(jīng)過納入、排除標(biāo)準(zhǔn)及部分樣本建庫(kù)、質(zhì)檢或測(cè)序失敗篩選后,最終納入CEGV組患者17例,HC組15例,2組性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)和吸煙、飲酒生活習(xí)慣比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組基本特征比較

2.2 OTU聚類Venn圖 樣品分為4組：HC組唾液(HCSa)、CEGV組唾液(CESa)、HC組糞便(HCFe)、CEGV組糞便(CEFe)。HCSa共有OTU 381個(gè),CESa共有OTU 451個(gè),2組共有OTU 362個(gè);HCFe 的OTU總數(shù)527個(gè),CEFe的OTU總數(shù)603個(gè),2組糞便標(biāo)本共有OTU總計(jì)423個(gè);共有73個(gè)OTU相互重疊。見圖1。

圖1 2組唾液及糞便OTU統(tǒng)計(jì)

2.3 物種積累曲線 本實(shí)驗(yàn)抽樣量足夠,繼續(xù)加大抽樣量,可能只會(huì)發(fā)現(xiàn)很少的新物種,抽樣結(jié)果可以代表唾液和糞便菌群特征,可以進(jìn)行下一步分析。見圖2。

圖2 物種累積曲線

2.4 物種相對(duì)豐度分布

2.4.1 在門水平上,發(fā)現(xiàn)2組唾液中擬桿菌門(Bacteroidetes)為最大優(yōu)勢(shì)菌群,擬桿菌門、梭桿菌門(Fusobacteria)豐度構(gòu)成比例差別不顯著,2組唾液間變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度存在明顯差異(P<0.05)。2組糞便絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門,HC組相對(duì)豐度為52.59%,CEGV組為49.81%,2組中變形菌門相對(duì)豐度差異明顯(P<0.05),與HC組糞便相比擬桿菌門、厚壁菌門呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。見表2。

表2 2組唾液和糞便在門水平上主要物種相對(duì)豐度構(gòu)成

2.4.2 在屬水平上,唾液菌群中普氏菌屬(Prevotella),是相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群;糞便中,擬桿菌屬(Bacteroides)、普氏菌屬占比較大。與HC組唾液相比,CEGV組唾液物種韋榮球菌屬(Veillonella)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HC組糞便菌群對(duì)比,CEGV組中鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮球菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)相對(duì)豐度有明顯差異(P<0.05)。見表3。

表3 2組唾液和糞便在屬水平上主要物種相對(duì)豐度構(gòu)成

2.5 LEFSe分析

2.5.1 GraPhlAn物種組成圖中,2組唾液菌群最內(nèi)層門水平藍(lán)色節(jié)點(diǎn)最大,代表Bacteroidetes(擬桿菌門) 是最大的優(yōu)勢(shì)菌群,其次可見紅色節(jié)點(diǎn)表示的厚壁菌門(Firmicutes),淺綠色表示變形菌門(Proteobacteria),綠色的梭桿菌門(Fusobacteria);外層熱力圖可見,HC組和CEGV組唾液物種優(yōu)勢(shì)菌群均為擬桿菌門下的普氏菌屬(Prevotella)。2組糞便中,綠色節(jié)點(diǎn)代表 厚壁菌門(Firmicutes)豐度最大,其次分別為紅色節(jié)點(diǎn)表示擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示變形菌門(Proteobacteria);外層熱力圖說明CEGV組中豐度所占比例最大的菌群為擬桿菌門中的擬桿菌屬(Bacteroides),HC組糞便菌群中優(yōu)勢(shì)菌群是擬桿菌門中的普氏菌屬。見表4。

表4 HC組與CEGV組唾液物種LDA值比較

2.5.2 HC組糞便中蘇黎世桿菌目(Turicibacterales)、蘇黎世桿菌科(Turicibacteraceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鏈球菌屬(Turicibacter、Streptococcus)、Alistipes是具有顯著差異的物種;CEGV組中芽孢桿菌綱(Bacilli)、紅椿菌綱(Coriobacteriia)、乳桿菌目(Lactobacillales)、放線菌目(Actinomycetales)、紅椿菌目(Coriobacteriales)、微球菌科(Micrococcaceae)、紅椿菌科(Coriobacteriaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、韋榮球菌屬(Veillonella)、羅氏菌屬(Rothia)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、腸球菌屬(Enterococcus)、Scardovia與健康組糞便菌群具有差異。見表5。

表5 HC組與CEGV組糞便物種LDA值

2.6 LEFSe分析 CEGV組唾液中差異顯著的物種是：厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、韋榮球菌科、擬桿菌科、擬桿菌屬、韋榮球菌屬;HC組唾液中差異物種是變形菌門、γ-變形菌綱、巴斯德氏菌目、巴斯德氏菌科、放線桿菌屬。HC組糞便中蘇黎世桿菌目、蘇黎世桿菌科、鏈球菌科、理研菌科、鏈球菌屬、Alistipes是具有顯著差異的物種;CEGV組中芽孢桿菌綱、紅椿菌綱、乳桿菌目、放線菌目、紅椿菌目、微球菌科、紅椿菌科、肉桿菌科、腸球菌科、乳桿菌科、乳桿菌屬、韋榮球菌屬、羅氏菌屬、顆粒鏈菌屬、腸球菌屬、Scardovia與健康組糞便菌群具有差異。

2.7 Alpha多樣性分析 生物Alpha多樣性主要是指豐富度(richness)和均勻度(evenness)這兩個(gè)主要因素。Chao1、Ace指數(shù)在生態(tài)學(xué)中側(cè)重于體現(xiàn)物種的豐富度,它的值表示這個(gè)樣本中物種的總數(shù),結(jié)果越高豐富度越高,Shannon、Simpson指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度,Shannon指數(shù)值越大代表群落多樣性越高,而Simpson指數(shù)相反,數(shù)值越大多樣性越低。2組唾液和糞便物種的抽樣量已足夠反應(yīng)群落的多樣性,HC組唾液標(biāo)本的Chao1指數(shù)大于CEGV組(P<0.05);2組唾液標(biāo)本間的Simpson指數(shù)比較,HC組小于GEVC組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HC組糞便的Chao1值大于CEGV組的數(shù)值,Simpson指數(shù)小于CEGV組,表明CEGV組腸道微生物多樣性存在降低趨勢(shì),但兩者的Chao1和Simpson指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6,圖3～6。

圖3 2組唾液Chao1指數(shù)稀疏曲線圖 圖4 2組唾液Simpson指數(shù)稀疏曲線圖 圖5 2組糞便Chao1指數(shù)稀疏曲線圖 圖6 2組糞便Simpson指數(shù)稀疏曲線圖

表6 2組唾液和糞便物種多樣性指數(shù)比較

3 討論

菌群的移位、過度生長(zhǎng)與機(jī)體的健康息息相關(guān),口腔、腸道菌群與肝硬化之間存在一定聯(lián)系,提出了“口腔-腸-肝軸”的理論[1,2]。腸道細(xì)菌跟隨血液循環(huán)移位到肝臟,代謝各種細(xì)菌產(chǎn)物,促進(jìn)門靜脈壓力提升;而門靜脈高壓會(huì)使腸壁水腫,細(xì)胞間隙增大,上皮完整性被破壞,加重細(xì)菌移位的發(fā)生。腸道菌群的變化主要是由口腔細(xì)菌大量入侵引起[4],肝臟和口腔之間通過受損的腸壁建立聯(lián)系,微生物及它們的代謝產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)從口腔可直接轉(zhuǎn)運(yùn)到體循環(huán)[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣本的測(cè)序深度和抽樣量足夠反映物種數(shù)量和多樣性。通過Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)2組口腔菌群的多樣性差異較小,但是2組的Chao1指數(shù)差異明顯,CEGV組唾液菌群的Simpson指數(shù)高于HC組,說明肝硬化食管胃底靜脈曲張患者的口腔菌群的豐富度發(fā)生了改變,與Li等[6]的研究部分結(jié)果一致。從門水平上分析2組唾液標(biāo)本發(fā)現(xiàn)口腔菌群主要是由擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門及梭桿菌門構(gòu)成,兩者變形菌門、厚壁菌門相對(duì)豐度構(gòu)成存在顯著差異,從屬水平角度觀察健康人群的唾液中韋榮球菌屬低于CEGV組(P<0.05)。韋榮球菌屬是厚壁菌門下的分支,革蘭陰性專性厭氧的無(wú)芽孢球菌,迄今為止,共發(fā)現(xiàn)14種韋榮球菌,7種可從口腔中分離,發(fā)現(xiàn)其不僅與口腔疾病有關(guān),還與肝硬化的發(fā)展存在相關(guān)性[7],Li等[6]結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致,肝硬化患者口腔菌群中的韋榮球菌屬明顯增加,他們更是提出韋榮球菌屬可作為預(yù)測(cè)肝病狀態(tài)的生物標(biāo)志物的理論。

CEGV組患者的糞便與HC組在Alpha多樣性指數(shù)相比存在下降趨勢(shì),但兩者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從物種差異分析可知,2組糞便在門水平上都是由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門等物種構(gòu)成,2組變形菌門含量存在明顯差異,從屬水平上可見,鏈球菌屬、韋榮球菌屬、顆粒鏈球菌屬和腸球菌屬相對(duì)豐度差異明顯。變形菌門是細(xì)菌門水平上最大的一類,因門下的細(xì)菌形狀具有多樣化而得名,其外膜主要有脂多糖構(gòu)成,研究發(fā)現(xiàn)變形菌門是人體微生物中最不穩(wěn)定的,它的豐度增多提示腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂,是一些疾病的潛在致病原因[8]。

在Beta多樣性降維分析中,糞便和唾液菌群可清楚的分為兩簇,兩類樣本的空間定位不一致,唾液菌群主要聚集在口腔中,糞便菌群分布較之更為廣泛,包括胃腔、小腸和大腸等。Venn圖顯示糞便中細(xì)菌物種數(shù)量多于口腔微生物數(shù)量,它們共享有73個(gè)物種,糞便與口腔菌群門水平上主要菌群構(gòu)成相似。從屬水平上分析,HC組和CEGV組唾液中優(yōu)勢(shì)菌群均為普氏菌屬,HC組糞便菌群同樣為普氏菌屬。口腔寄生菌中常見的奈瑟菌屬、卟啉單胞菌屬、纖毛菌屬和顆粒鏈球菌屬在健康人的腸道中存在很少,但由于肝硬化食管胃底靜脈曲張的影響,在CEGV組糞便發(fā)現(xiàn)其存在的比例高于健康人的糞便中,顆粒鏈球菌屬在2組糞便中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。顆粒鏈菌屬屬于人類口腔常見的優(yōu)勢(shì)菌,無(wú)動(dòng)力、不形成芽孢的革蘭陽(yáng)性球菌,除了與口腔疾病有密切關(guān)系,還與機(jī)體多系統(tǒng)疾病有關(guān)聯(lián)。加州大學(xué)一項(xiàng)關(guān)于30例肝硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn),顆粒鏈菌屬在肝硬化合并肝性腦病的患者中比肝硬化無(wú)肝性腦病的患者增加3.1倍[9],與本研究相同,另外還發(fā)現(xiàn)2組人群口腔中顆粒鏈球菌屬差異不明顯而腸道菌群中豐度所占比差異較大。有關(guān)成年人及老年人口腔菌群和腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn),老年人較成年人的口腔菌群在腸道中出現(xiàn)更為普遍,導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象出現(xiàn)原因很大部分是老年人胃腸道功能減退,膽汁酸和胃酸合成功能受到影響[10]。GEGV患者因血管擴(kuò)張充血,影響食管下括約肌的功能,動(dòng)靜脈短路,有效循環(huán)血流減少,腸壁黏膜損傷,防御機(jī)制及胃腸動(dòng)力功能、自主神經(jīng)功能減弱,在這種環(huán)境下,菌群移位的發(fā)生概率更高。本研究發(fā)現(xiàn),在GEGV狀態(tài)下,顆粒鏈球菌屬、卟啉單胞菌屬、纖毛菌屬更容易向腸道中轉(zhuǎn)移。

綜上所述,GEGV患者與健康人群口腔菌群在門水平和屬水平部分菌屬之間相對(duì)豐度存在差異,且健康人的口腔菌群的豐富度較高,2組人群腸道菌群屬水平上韋榮球菌屬、顆粒鏈球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬相對(duì)豐度不同,肝硬化食管胃底靜脈曲張患者腸道菌群Alpha多樣性有下降的趨勢(shì),且富集于口腔中的部分菌屬在肝硬化食管胃底靜脈曲張患者的體內(nèi)可能向腸道中轉(zhuǎn)移。