天麻素經(jīng)IRE1α/TRAF2/NF-κB通路調(diào)控大鼠急性心肌梗死誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)及機(jī)制研究

李小玲 鐘小蘭 方志敏 劉順民 劉兆平

急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是臨床常見的心血管疾病危重癥之一,具有發(fā)病突然、病死率高的特點,當(dāng)前經(jīng)皮冠狀動脈形成術(shù)及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物的應(yīng)用有效降低了AMI患者病死率[1]。但心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞,死亡后不可再生,而AMI后心肌組織釋放多種自身抗原,導(dǎo)致機(jī)體自身免疫反應(yīng),誘發(fā)一系列炎性反應(yīng),對心肌細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)性作用,引起心功能進(jìn)行性障礙,最終影響患者預(yù)后并增加患者猝死風(fēng)險。因此,尋找緩解AMI所致炎性反應(yīng)的有效藥物或靶點是醫(yī)藥研究工作者的重要課題[2-4]。天麻素(gastrodin)是提取自中藥蘭科天麻屬植物天麻塊莖的主要有效成分,具有抗菌、抗炎、抗氧化等廣泛的藥理作用[5]。Liu等[6]研究顯示,天麻素可抑制動脈粥樣硬化小鼠早期炎性反應(yīng)。楊偉等[7]研究報道,天麻素可通過抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕心臟缺血再灌注損傷,但天麻素作用于AMI的效果及作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究制備AMI大鼠模型,探究天麻素對AMI誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的影響并探討其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性SD大鼠,6～8周齡,體重180～200 g[新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002]。置于恒溫25℃動物房分籠飼養(yǎng),12 h明暗交替,自由進(jìn)食、飲水。天麻素(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司);腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenytetrazolium chloride,TTC)染色試劑盒、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗肌醇依賴性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α),磷酸化IRE1α(p-IRE1α)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2,TRAF2)、p65、磷酸化p65(p-p65)抗體、鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及AMI模型制備:50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(AMI)組、天麻素低劑量(L-GAD)組、天麻素高劑量(H-GAD)組、卡托普利(CAP)組,每組10只。除Sham組外,其他4組大鼠參照文獻(xiàn)[8]建立AMI大鼠模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定于手術(shù)臺上,氣管插管連接呼吸機(jī)后行開胸術(shù),采用6-0無菌絲線在左心耳下1～1.5 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支,左室前壁心肌顏色由鮮紅色變?yōu)樯n白色即為結(jié)扎成功,清理胸腔后關(guān)閉胸腔,逐層縫合。術(shù)后24 h大鼠心電圖可見ST段呈弓形向上型抬高,表示造模成功。Sham組大鼠同上述操作,僅穿線不結(jié)扎冠狀動脈。術(shù)后5組大鼠均使用10萬U青霉素抗感染,連續(xù)3 d。

1.2.2 藥物處理:術(shù)后24 h 造模成功后,L-GAD、H-GAD組大鼠分別按照50 mg/kg、100 mg/kg劑量尾靜脈注射給藥,CAP組大鼠尾靜脈注射6.25 mg/kg卡托普利,AMI組和Sham組大鼠尾靜脈注射相同劑量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續(xù)給藥4周后取大鼠組織標(biāo)本進(jìn)行檢測。

1.2.3 超聲心動圖檢測大鼠心功能變化情況:術(shù)后4周末,麻醉大鼠,進(jìn)行心臟超聲檢測,記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、收縮末期左心室內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVDs)、舒張末期左心室內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVDd)。

1.2.4 組織標(biāo)本收集:術(shù)后4周末,5組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,采用腹主動脈采血法處死大鼠,抽取的血液置于冰盒30 min后,在4℃條件下,3 500 r/min離心10 min,取上清液,分裝至1.5 ml的EP管,-80℃保存?zhèn)溆谩Ｕ〈笫笮呐K,置于4℃ 0.9%氯化鈉溶液浸泡,用無菌醫(yī)用紗布吸去多余水分,在心臟最大橫頸部位小心切開心臟,部分心肌組織置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h,隨后進(jìn)行組織脫水、透明、石蠟包埋等操作,制備石蠟切片,另一部分心肌組織裝入凍存管,置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 TTC染色評估大鼠心肌梗死面積比:取凍存的大鼠心肌組織,用磷酸緩沖鹽(PBS)溶液清洗后,將心肌組織切成5片冠狀切片,將切片置于1%的TTC染液中,37℃避光孵育20 min,隨后在4%多聚甲醛中固定24 h,拍照觀察,正常心肌區(qū)域呈現(xiàn)紅色,梗死區(qū)域呈現(xiàn)白色,計算心肌梗死面積比,梗死面積比=梗死區(qū)域面積/切面總面積×100%。

1.2.6 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化情況:取5組石蠟切片,脫蠟后用蘇木精染色10 min,自來水沖洗后,用1%的鹽酸乙醇溶液分化1 min,自來水洗滌后,再用伊紅染色3 min,沖洗后,將組織切片用不同濃度的乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1含量:取5組保存?zhèn)溆玫拇笫笱?按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1對應(yīng)的吸光度(OD)值,在提前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)樣本OD值查出相應(yīng)濃度,計算TNF-α、IL-6、MCP-1含量。

1.2.8 qRT-PCR檢測大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平:取5組大鼠心肌組織,加入Trizol試劑提取組織總RNA,紫外分光光度法測定總RNA得純度和濃度,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書配置qRT-PCR實驗反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃ 15 min,95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共進(jìn)行40個循環(huán),以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt定量方法計算目的基因相對表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot法檢測大鼠心肌組織中IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達(dá)情況:取凍存的心肌組織,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5 %脫脂牛奶中室溫封閉1 h,加入IRE1α(1∶1 000)、p-IRE1α(1∶1 000)、TRAF2(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影后,以β-actin作為內(nèi)參蛋白,使用凝膠成像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對大鼠心功能及心肌梗死面積比的影響 Sham組大鼠心功能參數(shù)正常,未見心肌梗死;與Sham組比較,AMI組大鼠心功能參數(shù)LVEF顯著降低,LVDs和LVDd顯著升高,且存在明顯的心肌梗死,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心功能參數(shù)LVEF均顯著升高,LVDs和LVDd均顯著降低,且心肌梗死面積比均顯著減小,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);H-GAD組和CAP組大鼠心功能參數(shù)LVEF、LVDs、LVDd及心肌梗死面積比變化程度與L-GAD組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 天麻素對大鼠心功能及心肌梗死面積比的影響 n=10,

圖1 天麻素對大鼠心肌梗死面積比的影響(TTC染色檢測大鼠心肌梗死面積比)

2.2 天麻素對大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響 Sham組心肌細(xì)胞排列整齊、核結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常;AMI組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞著色不均,發(fā)生大量變性、壞死,心肌纖維腫脹、斷裂,可見大量炎性細(xì)胞浸潤;與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織損傷明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少,且H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織損傷改善較L-GAD組更為顯著。見圖2。

2.3 天麻素對大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著降低(P<0.05),且H-GAD組和CAP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見表3。

圖2 天麻素對大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響(HE×400)

表3 天麻素對大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影響 n=10,pg/ml,

2.4 天麻素對大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),且H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)量較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見表4。

表4 天麻素對大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)的影響 n=10,pg/ml,

2.5 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達(dá)量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD和H-GAD組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達(dá)量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均顯著降低(P<0.05),且H-GAD組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達(dá)量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見圖3,表5。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),天麻素具有抗炎、抗氧化、抗血小板、降低血壓和增強(qiáng)免疫功能的作用,對中樞系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等均具有較強(qiáng)的藥理活性[9]。Li等[10]研究表明,天麻素通過激活PI3K-Akt通路中mTOR信號抑制細(xì)胞自噬,從而保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷。Fu等[11]報道,天麻素預(yù)處理通過促進(jìn)自噬流量減輕心肌缺血再灌注損傷。Xing等[12]報道,天麻素通過上調(diào) microRNA-21保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞 H9c2免受缺氧損傷。本研究建立AMI大鼠模型,造模后,HE染色法觀察顯示AMI大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,發(fā)生大量變性、壞死,心肌纖維腫脹、斷裂,存在大量炎性細(xì)胞浸潤;TTC法檢測顯示AMI大鼠存在明顯的心肌梗死;同時,大鼠心功能參數(shù)發(fā)生異常。經(jīng)過天麻素干預(yù)后,大鼠心肌組織病理損傷減輕,心肌梗死面積減小,心功能參數(shù)顯著改善,提示天麻素能夠減輕AMI引起的心肌損傷。

圖3 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

表5 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 n=10,pg/ml,

炎性反應(yīng)是機(jī)體常見的病理過程,可發(fā)生于機(jī)體各組織和器官,AMI后,梗死區(qū)缺血缺氧,心肌能力供給不足,心肌細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激及鈣離子通道等多方面改變使得細(xì)胞發(fā)生壞死與凋亡,進(jìn)一步引起強(qiáng)烈的炎性反應(yīng),加重心肌損傷。抑制AMI后過度炎性反應(yīng)可能對心功能改善起積極的影響[13]。TNF-α和IL-6作為炎癥及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的重要細(xì)胞因子,臨床檢查顯示TNF-α和IL-6在心血管疾病患者的心肌組織中高表達(dá),且表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[14]。MCP-1在心肌缺血中屬于較為活躍的趨化因子,可誘導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞趨化并黏附,參與心肌缺血誘導(dǎo)的炎性反應(yīng),促進(jìn)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[15]。TNF-α、IL-6、MCP-1共同參與梗死心肌炎性反應(yīng)的全過程,調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、MCP-1的釋放對減輕心肌缺血性損傷至關(guān)重要。Han等[16]報道,天麻素通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的表達(dá),對心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。本研究中,AMI大鼠血清及心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子表達(dá)均升高。天麻素干預(yù)后,AMI大鼠血清及心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子水平均顯著降低,提示天麻素對AMI誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有一定抑制作用。

TRAF2是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族中的一員,可與腫瘤壞死因子受體家族的多個受體結(jié)合,介導(dǎo)相關(guān)因子的生理活化,被認(rèn)為是調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)的關(guān)鍵上游因子。IRE1α則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中參與未折疊蛋白激活的保守信號通路的重要組成部分。IRE1α通過與TRAF2結(jié)合被磷酸化激活,導(dǎo)致NF-κB通路的激活,而NF-κB的激活是抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的重要步驟,NF-κB包含p65、p50等多個亞單位,在正常生理狀態(tài)下,以無活性的同源二聚體形式存在,當(dāng)多種病理因素刺激時,NF-κB被磷酸化被激活,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與特定靶基因結(jié)合發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用,釋放炎性因子等,導(dǎo)致組織過度炎性反應(yīng)及損傷。多項研究報道,IRE1α/TRAF2/NF-κB通路通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[17]。Yuan等[18]研究發(fā)現(xiàn),天麻素可通過介導(dǎo)IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示,AMI大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達(dá)量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明顯升高,而經(jīng)過天麻素干預(yù)后,AMI大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達(dá)量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明顯降低。該結(jié)果提示天麻素可能通過調(diào)控IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制AMI誘導(dǎo)的炎性反應(yīng),減輕AMI大鼠心肌損傷和心肌梗死面積。