腦膠質(zhì)瘤組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)與全切術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系及意義

王杰 張川

由于腦膠質(zhì)瘤放化療的抵抗性、增殖遷移能力強(qiáng)等,導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率較高,因此如何預(yù)防及延緩復(fù)發(fā)是現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)[1]。盡管目前關(guān)于腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)影響因素的研究較多,但缺乏關(guān)于分子機(jī)制的研究,且根據(jù)既往資料,即使是一般資料均衡可比患者,術(shù)后復(fù)發(fā)情況亦不盡相同[2,3],提示有其他機(jī)制影響了腦膠質(zhì)瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)。組織配對盒基因3(Pax3)可調(diào)控細(xì)胞增殖、改變特異細(xì)胞系分化、促進(jìn)細(xì)胞自我更新等,下調(diào)Pax3的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖進(jìn)展,并能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[4]。脯氨酰4-羥化酶亞基α1(P4HA1)可改變細(xì)胞外基質(zhì)成分,在肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高,且P4HA1過表達(dá)能通過促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,介導(dǎo)不良預(yù)后發(fā)生[5]。Rac GTP酶激活蛋白酶1(Rac1)在乳腺癌中,其激活是與放化療抵抗性相關(guān)的預(yù)后危險(xiǎn)因素[6]。本研究探討組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤全切術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2021年6月80例腦膠質(zhì)瘤全切術(shù)患者作為研究對象,其中男51例,女29例;年齡30～69歲,平均年齡(51.69±10.08)歲。根據(jù)是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組。經(jīng)本院倫理委員會審核通過。患者及親屬知情,自愿簽署同意書。2組年齡、體重指數(shù)、性別比、術(shù)前KPS評分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)發(fā)組病理分級、術(shù)后輔助治療情況與未復(fù)發(fā)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組基線資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①符合腦膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②具有腦膠質(zhì)瘤全切術(shù)的指征[7];③首次接受治療,承諾可配合隨訪;④患者或家屬簽署知情同意書;⑤年齡>18歲。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤及腦部轉(zhuǎn)移瘤者;②脫落、失訪者;③身體一般情況較差,不能耐受手術(shù)者;④有出血傾向或合并出血類疾病者。

1.3 方法

1.3.1 主要儀器與試劑:Trizol RNA提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司);氯仿(武漢易司拓普科技);Quanti Tect 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根公司);Taq DNA聚合酶(美國Thermo Fisher公司);dNTP(上海博雅生物);引物設(shè)計(jì)(上海擎科);PCR緩沖液(武漢卡諾斯科技);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國MJ,PTC-100型);核酸電泳儀(上海譜振生物EPZ-100);紫外可見分光光度計(jì)(美國PHARMACIA公司,UV-2000型)。

1.3.2 組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)檢測:取手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,充分研磨后用Trizol RNA提取試劑盒提取RNA。加入氯仿混勻孵育后離心,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等體積的異丙醇,孵育、離心、棄上清。75%乙醇洗滌沉淀后離心,真空干燥5 min,加入水溶解RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng),反應(yīng)體系包括上下游引物各1 μl、Taq DNA聚合酶1 μl、cDNA 5 μl、dNTP 1 μl、PCR緩沖液10 μl、ddH2O 2 μl,反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性3 min,93℃預(yù)變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán),各檢測基因表達(dá)量采用分析2-ΔΔCt法。見表2。

表2 Pax3、P4HA1、Rac1基因引物序列

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較2組Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá);(2)分析腦膠質(zhì)瘤全切術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素;(3)分析Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)的價(jià)值;(4)比較不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)水平患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 2組組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)比較 復(fù)發(fā)組組織Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表達(dá)高于未復(fù)發(fā)組(P<0.05)。見表3。

表3 2組組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)比較

2.2 復(fù)發(fā)多因素分析 校正了病理分級、術(shù)后輔助治療情況后,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA仍是復(fù)發(fā)的獨(dú)立相關(guān)危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 復(fù)發(fā)的Logistic回歸分析

2.3 組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)的ROC曲線 繪制各基因預(yù)測復(fù)發(fā)的ROC曲線顯示,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA預(yù)測復(fù)發(fā)的AUC依次為0.840、0.825、0.828,采用SPSS的LogP模式構(gòu)建三者聯(lián)合預(yù)測復(fù)發(fā)的Logistic預(yù)測模型,結(jié)果顯示其AUC為0.940。見表5,圖1。

表5 組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)的ROC分析結(jié)果

圖1 組織Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)的ROC曲線

2.4 不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)水平患者復(fù)發(fā)時(shí)間比較 Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高水平患者復(fù)發(fā)時(shí)間短于低水平患者(P<0.05)。見表6。

3 討論

目前腦膠質(zhì)瘤仍缺乏行之有效的療法,即使給予手術(shù)+放化療,患者總體生存率仍較低,其最主要的原因在于術(shù)后復(fù)發(fā)。朱一碩等[8]報(bào)道，病理分級、術(shù)后輔助治療情況均與術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān),本研究得到了類似的結(jié)論,且本研究還發(fā)現(xiàn),校正了病理分級、術(shù)后輔助治療情況后,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1mRNA仍是復(fù)發(fā)的獨(dú)立相關(guān)危險(xiǎn)因素。

表6 不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表達(dá)水平患者復(fù)發(fā)時(shí)間比較 月,

Pax3 mRNA系胚胎發(fā)育過程中一種重要的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中,Pax3 mRNA能負(fù)性調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白,從而影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化過程[9]。沉默Pax3 mRNA被證實(shí)可抑制胃癌、前列腺癌等多種癌癥進(jìn)展,故Pax3 mRNA可能是多種惡性腫瘤共享的促癌因子[10,11]。聶德康等[12]報(bào)道,表明Pax3 mRNA與腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。Pax3 mRNA高表達(dá)患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性程度高,增殖、遷移能力強(qiáng),術(shù)后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞自我更新、重生概率較大,所以復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增大。Pax3 mRNA預(yù)測復(fù)發(fā)的AUC為0.840,在單一指標(biāo)中最高,且其單一應(yīng)用時(shí),預(yù)測復(fù)發(fā)的特異度達(dá)90.91%,可作為預(yù)測腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的一個(gè)特異性標(biāo)志物。

P4HA1可調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)重塑,起到影響腫瘤黏附、遷移等作用,在乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤中均起到促癌因子作用,但在腦膠質(zhì)瘤患者中的研究較少[13,14]。本研究結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)組P4HA1 mRNA高于未復(fù)發(fā)組,與術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。方勝等[15]體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)說明P4HA1 mRNA高表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)起到消極作用。本研究發(fā)現(xiàn),P4HA1 mRNA預(yù)測復(fù)發(fā)的AUC為0.825,敏感度為75.00%,特異度為81.82%,呈現(xiàn)出一定預(yù)測價(jià)值。可見P4HA1 mRNA有望成為預(yù)防腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)作用靶點(diǎn),沉默或抑制P4HA1 mRNA表達(dá),可改善腫瘤惡性程度,從而為臨床預(yù)防腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)提供了一個(gè)新思路。

Rac1 mRNA定位于染色體7p22,被激活后可影響細(xì)胞的形態(tài)極化,促進(jìn)細(xì)胞骨架重建。本研究顯示,復(fù)發(fā)組Rac1 mRNA表達(dá)高于未復(fù)發(fā)組,與腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)獨(dú)立相關(guān)。一方面高表達(dá)的Rac1 mRNA可增強(qiáng)癌細(xì)胞的干性,從而增加術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn);另一方面高表達(dá)的Rac1 mRNA可增加腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放化療耐性,抑制Rac1 mRNA能通過靶向腫瘤代謝,使癌細(xì)胞對DNA損傷劑敏感,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤化療抗性[16,17]。Rac1 mRNA最重要的下游效應(yīng)器之一是絲氨酸/蘇氨酸激酶、p21激活激酶1,而絲氨酸/蘇氨酸激酶、p21激活激酶均是癌癥易感性的重要物質(zhì)[18]。因此靶向Rac1 mRNA可能通過癌細(xì)胞干性、腫瘤代謝、放化療敏感性等多個(gè)途徑,減少腦膠質(zhì)瘤術(shù)后的復(fù)發(fā),促進(jìn)病情的良好轉(zhuǎn)歸。但Baker等[19]報(bào)道,大量侵襲性癌細(xì)胞系顯示出的Rac1水平升高,是檢測方法造成的誤導(dǎo)性結(jié)論,具有低Rac1激活水平的癌癥仍然顯示抗Rac1抗體的高信號,本研究觀點(diǎn)與之不同,其原因可能是,以上報(bào)道所用的檢測方法是免疫熒光分析法,其檢測結(jié)果依賴于抗Rac1抗體,而本研究采用的是不依賴于抗Rac1抗體的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈法,因此能夠準(zhǔn)確反映腦膠質(zhì)瘤組織中Rac1 mRNA表達(dá)情況。Rac1 mRNA預(yù)測復(fù)發(fā)的AUC與P4HA1 mRNA相近,但Rac1 mRNA的敏感度為83.33%,在單一指標(biāo)中最高,呈現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。同時(shí)Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA聯(lián)合Rac1 mRNA預(yù)測復(fù)發(fā)的AUC大于任一單一指標(biāo),預(yù)測可靠性與預(yù)測敏感度進(jìn)一步提升,故建議聯(lián)合檢測三者作為術(shù)后復(fù)發(fā)的一個(gè)預(yù)測方案。

在以上研究基礎(chǔ)上,本研究還發(fā)現(xiàn),Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高水平患者復(fù)發(fā)時(shí)間短于低水平患者,提示三者的高表達(dá)不僅與復(fù)發(fā)有關(guān),還與患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間有關(guān),Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA水平越高,患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度越高。郭合伏等[20]報(bào)道,顱內(nèi)膠質(zhì)瘤組織高表達(dá)的Rac1 mRNA與患者生存期呈負(fù)相關(guān),佐證了Rac1 mRNA參與腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。從本研究結(jié)果可知,檢測患者腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表達(dá)有助于早期預(yù)測患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),并初步評估患者復(fù)發(fā)時(shí)間,對Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高表達(dá)患者,應(yīng)建議患者盡可能完善術(shù)后放療、化療,并及時(shí)調(diào)整放化療方案,而最大化患者受益。

綜上,腦膠質(zhì)瘤組織中Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表達(dá)與全切術(shù)后復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)時(shí)間相關(guān),單一指標(biāo)中Pax3 mRNA預(yù)測特異度最高,Rac1 mRNA預(yù)測敏感度最高,三者聯(lián)合預(yù)測復(fù)發(fā)的可靠性與敏感度進(jìn)一步提高,能為臨床早期精準(zhǔn)干預(yù)提供重要的參考依據(jù)。