circAMOTL1靶向調(diào)控miR-379-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

周毛仔 陳怡 周進(jìn)軍

宮頸癌是常見的婦科惡性癌癥,其全球范圍死亡率和發(fā)病率在所有女性癌癥位居第四,對(duì)女性健康造成嚴(yán)重的威脅,宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)常用外科手術(shù)切除,治療效果明顯,但是70%宮頸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期,一些情況下還伴有轉(zhuǎn)移、侵襲等出現(xiàn)[1,2]。近年來,靶向治療是當(dāng)前宮頸癌研究和治療的熱點(diǎn)。環(huán)狀RNA(circRNA)是非編碼RNA分子的一員,具有穩(wěn)定的環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu),circRNA被發(fā)現(xiàn)具有致癌性和抑制性,對(duì)多種人類疾病和癌癥至關(guān)重要[3,4]。最近的研究發(fā)現(xiàn),circAMOTL1在宮頸癌組織和細(xì)胞表達(dá)上調(diào),敲低circAMOTL1能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,通過調(diào)控miR-526b/SIK2軸促進(jìn)宮頸癌惡性發(fā)展[5]。circRNA與下游miRNA能相互作用參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展,miR-379-5p多種癌癥中表達(dá)下調(diào)(如肝癌、非小細(xì)胞肺癌等),過表達(dá)miR-379-5p能抑制癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6,7]。關(guān)于circAMOTL1和miR-379-5p二者間的研究尚不明確,通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示circAMOTL1和miR-379-5p存在互補(bǔ)的核苷酸序列,本研究以宮頸癌細(xì)胞Caski為研究對(duì)象,觀察circAMOTL1靶向miR-379-5p的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 從本院收集30例宮頸癌患者組織和癌旁組織,經(jīng)過專家對(duì)其病理確認(rèn)為宮頸癌組織和癌旁組織,將組織放在液氮罐內(nèi)冷凍保存。所有患者在進(jìn)行手術(shù)前未進(jìn)行任何化療或放療,且患者均簽署了患者知情同意書。該研究已經(jīng)獲得了本院倫理委員會(huì)同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7、宮頸癌細(xì)胞SiHa、Caski、HeLa、C33a購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1、anti-miR-NC、anti-miR-379-5p、引物由上海吉瑪設(shè)計(jì)合成;LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自上海加科生物科技有限公司;TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;MTT試劑盒購(gòu)自碧云天生物;周期試劑盒、凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物;CyclinD1抗體、Ki67抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司;熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7、宮頸癌細(xì)胞SiHa、Caski、HeLa、C33a于37℃、5% CO2培養(yǎng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞須含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)融合至85%時(shí),加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期Caski細(xì)胞以每孔內(nèi)接種2×105個(gè),并接種至6孔板中,按照脂質(zhì)體法將si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi),記為si-NC組、si-circAMOTL1組、pcDNA組、pcDNA-circAMOTL1組;將si-circAMOTL1和anti-miR-NC、si-circAMOTL1和anti-miR-379-5p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi),記為si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)circAMOTL1和miR-379-5p的表達(dá)量 取癌旁組織、宮頸癌組織、正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7、宮頸癌細(xì)胞(SiHa、Caski、HeLa、C33a)、以及各組Caski細(xì)胞,加入TRIzol試劑用于提取總RNA,對(duì)RNA進(jìn)行定量和評(píng)估。然后配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,取3 μg的總RNA將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)熒光定量試劑盒說明書步驟配置反應(yīng)體系,在PCR儀器進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH和U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算circAMOTL1和miR-379-5p的表達(dá)量。circAMOTL Forward:5’-GATGGTCAAGCCCTACCCTG-3’,Reverse:5’-CCCTGATGCTACTGGTTGCC-3’;miR-379-5p Forward:5’-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3’,Reverse:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細(xì)胞,并接種至96孔板中,每孔接種2 000個(gè),放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h、72 h,在每孔內(nèi)加入20 μl的MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h吸去培養(yǎng)液,加入150 μl二甲基亞砜試劑。用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)每孔內(nèi)吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 取對(duì)數(shù)期si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后吸取10 ml上清液至EP管內(nèi),加入胰蛋白酶進(jìn)行消化,沖洗2遍,加入預(yù)冷75%乙醇試劑進(jìn)行重懸,4℃固定24 h,按照周期試劑盒說明書,加入RNA酶孵育20 min,然后加入PI試劑,避光反應(yīng)30 min,置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。加入胰酶消化后,按照凋亡試劑盒說明,將100 μl的Binding Buffer與Annexin V-FITC和PI試劑混勻,避光反應(yīng)15 min,置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。

1.7 Western blot檢測(cè)CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細(xì)胞,加入蛋白裂解液,冰上反應(yīng)30 min提取各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白,按照BCA法定量評(píng)估蛋白。每孔上樣量為30 μg與上樣緩沖液反應(yīng)3 min,行SDS-PAGE處理,將處理的蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜上,然后用脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h,洗膜3次,加入CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體,4℃孵育過夜,室溫下加入帶有標(biāo)記的二抗,孵育1 h,在PVDF膜滴加ECL顯色液,顯色、曝光。應(yīng)用Image分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circAMOTL1和miR-379-5p的靶向關(guān)系 通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circAMOTL1 3’UTR與miR-379-5p結(jié)合位點(diǎn),為了驗(yàn)證miR-379-5p是否是circAMOTL1的靶標(biāo)。將構(gòu)建circAMOTL1野生型(circAMOTL1 WT)和突變型(circAMOTL1 MUT)熒光序列載體與miR-NC或miR-379-5p共轉(zhuǎn)染至Caski細(xì)胞內(nèi),培養(yǎng)48 h后,根據(jù)熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌組織中的表達(dá) 與癌旁組相比,宮頸癌組織內(nèi)circAMOTL1表達(dá)量顯著增加(P<0.05),miR-379-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)

2.2 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7相比,宮頸癌細(xì)胞SiHa、Caski、HeLa和C33a內(nèi)circAMOTL1表達(dá)量顯著增加(P<0.05),miR-379-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。因此選擇表達(dá)量差異相對(duì)較大Caski細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。

表2 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組相比,si-circAMOTL1組內(nèi)circAMOTL1表達(dá)量顯著降低(P<0.05),48h、72h內(nèi)OD值顯著降低(P<0.05),G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05),S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1,表3。

表3 敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和周期的影響

2.4 敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組相比,si-circAMOTL1組內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。見圖2,表4。

圖2 敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響;A 凋亡圖;B 蛋白圖

2.5 circAMOTL1靶向調(diào)控miR-379-5p的表達(dá) 通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示,circAMOTL1和miR-379-5p互補(bǔ)核苷酸序列。為了進(jìn)一步驗(yàn)證二者間的關(guān)系,雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-379-5p組內(nèi)circAMOTL1 WT熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),circAMOTL1 MUT熒光素酶活性沒有顯著變化。與pcDNA組相比,pcDNA-circAMOTL1組內(nèi)circAMOTL1表達(dá)量顯著上升(P<0.05),miR-379-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖3,表5、6。

表4 敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

圖3 circAMOTL1和miR-379-5p互補(bǔ)核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 circAMOTL1調(diào)控miR-379-5p的表達(dá)

2.6 抑制miR-379-5p部分回復(fù)敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-circAMOTL1+anti-miR-NC組相比,si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組內(nèi)miR-379-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.05),48 h、72 h內(nèi)OD值顯著上升(P<0.05),G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),S期細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表7、8,圖4。

表7 抑制miR-379-5p部分回復(fù)敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

表8 抑制miR-379-5p部分回復(fù)敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和周期的影響

圖4 抑制miR-379-5p部分回復(fù)敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響;A 蛋白圖;B 凋亡圖

3 討論

宮頸癌作為常見的惡性腫瘤,雖然宮頸癌的診斷和治療方法已經(jīng)取得了進(jìn)步,但是患者的不良預(yù)后、復(fù)發(fā)是當(dāng)前治療的難題[8]。circRNA是新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源RNA,在多種癌癥內(nèi)異常表達(dá),可以作為癌癥的潛在生物標(biāo)記物[9,10]。circAMOTL1位于人染色體11上,在癌癥內(nèi)表達(dá)上調(diào),如circAMOTL1在乳腺癌組織內(nèi)表達(dá)上調(diào),通過參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡等促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[11]。Liu等[12]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circAMOTL1在口腔鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)表達(dá)上調(diào),circAMOTL1通過調(diào)控miR-22-3p/miR-1294促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。Ou等[13]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circAMOTL1宮頸組織內(nèi)表達(dá)上調(diào),與不良預(yù)后有關(guān),抑制circAMOTL1能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,通過調(diào)控miR-485-5p/AMOTL1軸發(fā)揮在宮頸癌內(nèi)的作用。以上均說明circAMOTL1在癌癥內(nèi)起到促癌的作用,可以作為宮頸癌的潛在標(biāo)記物,本研究結(jié)果顯示,通過qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞內(nèi)circAMOTL1的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)circAMOTL1在宮頸癌組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào),通過體功能實(shí)驗(yàn)觀察敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用。結(jié)果顯示抑制circAMOTL1能降低宮頸癌細(xì)胞內(nèi)OD值,增加G0/G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率,減少S期細(xì)胞比例,下調(diào)CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表達(dá),上調(diào)Bax蛋白表達(dá),說明circAMOTL1在宮頸癌起著促癌的作用,這與上述結(jié)果相似。

miR-379-5p屬于miR-379家族,在人類癌癥中表達(dá)異常失調(diào),能參與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14,15]。Jiang等[16]研究結(jié)果顯示,在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中miR-379-5p表達(dá)下調(diào),miR-379-5p通過靶向β-arrestin-1的表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),miR-379-5p在乳腺癌組織內(nèi)表達(dá)下調(diào),LINC00665負(fù)調(diào)控miR-379-5p的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]。陳昆等[18]研究結(jié)果顯示,miR-379-5p在膀胱癌組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-379-5p能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究結(jié)果顯示miR-379在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),與癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[19],過表達(dá)miR-379能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。以上均說明miR-379-5p在癌癥中表達(dá)失常,可以作為多種癌癥的標(biāo)記物,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-379-5p在宮頸癌組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下調(diào),說明miR-379-5p在宮頸癌中起著抑癌的作用,這與上述結(jié)果一致。通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示miR-379-5p是circAMOTL1靶基因,qRT-PCR結(jié)果顯示,過表達(dá)circAMOTL1能降低miR-379-5p的表達(dá)水平,說明circAMOTL1靶向負(fù)調(diào)控miR-379-5p。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制miR-379-5p可以逆轉(zhuǎn)敲低circAMOTL1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用,說明circAMOTL1靶向負(fù)調(diào)控miR-379-5p促進(jìn)宮頸癌惡性發(fā)展。

綜上所述,circAMOTL1在宮頸癌組織和細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),敲低circAMOTL1能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,并阻滯細(xì)胞周期,其作用機(jī)制可能與miR-379-5p有關(guān),為宮頸癌的治療和診斷提供新的靶標(biāo)。