SiRNA誘導ROR2表達下調抑制軟骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲

黃建軍 石鶯 劉泉 陳忠益 曾國慶 趙柏陽

軟骨肉瘤作為發病率排名第二的原發惡性骨腫瘤,對放化療具有很強的抵抗作用,外科手術治療術后易出現復發和轉移,使得預后效果較差[1],嚴重危及患者生命。因此,探索并闡明軟骨肉瘤的發生發展機制,尋找有效的治療靶點是治療軟骨肉瘤的重要策略。受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,ROR2)是受體酪氨酸激酶家族(RTKs)成員之一,參與體內細胞增殖調控、凋亡、分化、黏附、遷移等多種重要的細胞生理活動,在動物發育的形態發生及組織分化過程中發揮重要作用[2]。研究表明,ROR2參與調節成骨細胞的存活和分化從而影響骨發育和重塑[3,4]。正常組織中ROR2的表達水平較低,而在多種腫瘤組織或細胞(如慢性淋巴細胞性白血病、惡性黑色素瘤、頭頸鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌等)中呈高表達,并加速腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程[5-8]。我們前期的研究發現ROR2在骨肉瘤組織及細胞中有較強表達,并可能促進了骨肉瘤的發生發展及惡性生物學行為[9,10]。但筆者發現ROR2在軟骨肉瘤中的功能尚不清楚。本實驗擬采用體外培養人軟骨肉瘤SW1353細胞,應用小干擾RNA(SiRNA)特異性下調SW1353細胞中ROR2的表達水平,觀察其對軟骨肉瘤SW1353細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,以期為軟骨肉瘤的臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人軟骨肉瘤細胞系SW1353購于美國ATCC公司;RPMI-1640培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司;Lipofectamine 2000轉染試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司;Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、化學發光試劑盒、CCK-8試劑盒及RIPA裂解液購于碧云天生物公司;鼠抗人ROR2單克隆抗體購于美國novus公司;Transwell小室購自美國Corning公司。小干擾RNA序列由上海博亞公司合成、純化。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及分組:人軟骨肉瘤SW1353細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液,37℃恒溫培養箱,5%的CO2,相對飽和濕度95%的條件下培養。根據細胞生長狀態,每2～3天更換1次新鮮培養液,待細胞生長至匯合度達85%左右時,以胰酶消化傳代。轉染前24 h,胰酶消化處于對數生長期的細胞并計數,用無抗生素含10%胎牛血清的RPMI1640培基稀釋細胞后傳代于6孔板(1×106個/孔)中,保證細胞貼壁后的密度為60%～70% 時,嚴格按SiRNA轉染說明書進行相應的轉染。將不做任何處理的人軟骨肉瘤SW1353細胞記為空白對照組、將轉染了NC-SiRNA的SW1353細胞作為陰性對照組(記為NC組),將轉染了ROR2-SiRNA的SW1353細胞作為實驗組(記為ROR2-SiRNA組)。

1.2.2 qRT-PCR檢測轉染后細胞中ROR2 mRNA表達水平:通過qRT-PCR檢測轉染效果。轉染48 h后收集各組細胞,用Trizol試劑提取3組細胞總RNA,紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度后,逆轉錄合成cDNA。調整cDNA濃度為50 ng/μl后進行熒光定量PCR擴增,以GAPDH基因為內參,用相對定量 2-ΔΔCT計算細胞中ROR2 mRNA相對表達水平。見表1。

表1 引物序列

1.2.3 Western blot檢測各組細胞中ROR2蛋白表達水平:收集轉染后48 h的后3組SW1353細胞,胰酶消化細胞,1 500 r/min離心10 min,加入100 μl總蛋白提取液,用移液器充分吹打,直到細胞完全被溶解。超聲3次,3 s/次。4℃下12 000 min,離心10 min,取上清,BCA法(按試劑盒說明書步驟進行)測定總蛋白濃度。將總蛋白混合液:蛋白上樣緩沖液=4∶1,混勻,100℃加熱3 min使蛋白質變性。離心取上清液20 μl進行12%濃度的SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入鼠抗人ROR2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,PBST洗膜3次(5 min/次)后,加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h。暗室中加入化學發光ECL顯影液顯影曝光后,凝膠成像系統曝光拍照,計算目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值用以表示ROR2蛋白相對表達水平。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力:取對數生長期的各組細胞接種于96孔板中,每組設6個復孔(6×103個/孔),應用CCK-8法分析各組細胞增殖能力是否存在不同。各組細胞分別在37℃下孵育0、24、48和72 h后加入10 μl的CCK-8溶液(每個時間點均設置3個平行復孔),繼續在培養箱中孵育2 h,在酶標儀450 nm處測定各孔細胞的光密度(OD)值。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力:取對數生長期的各組細胞以5×105個細胞/孔的濃度接種到6孔板中過夜。當細胞達到融合時,用無菌20 μl槍頭尖端垂直于橫線劃痕,PBS洗滌3次后,加入無血清培養基。37℃,5%CO2培養箱孵育,于劃痕后0、48 h在同一位置用倒置顯微鏡觀察拍照,Image J軟件測量劃痕面積,計算相對劃痕愈合率。相對劃痕愈合率=實驗組(0 h劃痕面積-48 h劃用痕面積)/對照組(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)。

1.2.6 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力:用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部,4℃風干。將Transwell小室放入24孔細胞板上,取對數生長期細胞制成1×106個/ml無血清細胞懸液,將200 μl的單細胞懸液加入小室上室中,下室中加入600 μl含胎牛血清的完全培養基,置于培養箱內常規培養24 h后,取出小室。用40 g/L多聚甲醛固定20 min,0.1%結晶紫染色10 min,棉簽小心拭去上室面的細胞,PBS清洗殘留染色液,倒置顯微鏡下每組隨機選取取5個視野拍照并計數。

2 結果

2.1 3組SW1353細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平比較 ROR2-SiRNA組ROR2 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于空白對照組和NC組(P<0.05),而空白對照組和NC組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1,表2。

圖1 3組SW1353細胞中ROR2蛋白表達水平;1 空白對照組;2 NC組;3 ROR2-SiRNA組

表2 3組SW1353細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平

2.2 3組SW1353細胞增殖能力比較 相同的作用時間,ROR2-SiRNA組OD值明顯低于空白對照組和NC組(P<0.05),而空白對照組與NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組細胞增殖能力比較

2.3 3組SW1353細胞劃遷移、侵襲能力 細胞劃痕實驗結果顯示,與NC組相比,ROR2-SiRNA組腫瘤細胞的遷移距離明顯變短,遷移能力明顯受到抑制,差異有統計學意義(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示,與NC組比較,ROR2-SiRNA組的穿膜細胞數明顯減少,侵襲能力明顯減弱,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 細胞劃痕實驗檢測2組SW1353細胞的遷移能力(×100)

圖3 Transwell實驗檢測2組SW1353細胞的侵襲能力(HE×100)

表4 2組SW1353細胞的遷移距離及穿膜細胞數的比較n=9,

3 討論

軟骨肉瘤是一種常見的起源于軟骨組織[11]的惡性骨腫瘤,其發病率僅次于骨肉瘤,好發于骨盆、股骨近端和肱骨近端、肋骨外,還可以發生于椎骨、骶骨、鎖骨、肩胛骨和足骨[12]。大多數軟骨肉瘤繼發于良性軟骨瘤,如內生軟骨瘤和骨軟骨瘤。作為一種較為罕見且尚未被研究透徹的肉瘤的一種亞型,軟骨肉瘤具有高度異質性并且難以治療。因其對放療和化療不敏感,目前手術切除仍然是軟骨肉瘤惟一有效的治療方法[13]。而術后復發和轉移是導致絕大多數軟骨肉瘤患者預后不良的主要原因。研究表明,除了染色體異常等因素外,軟骨肉瘤的發生發展還與多種癌基因的異常激活和腫瘤抑制因子的失活有關,但其發生發展的分子機制仍尚不清楚[14]。尋找影響軟骨肉瘤細胞惡性生物學行為的致癌基因,并探討調節軟骨肉瘤生長和轉移的分子機制將有助于開發新的治療策略。

ROR2作為受體酪氨酸激酶家族(RTKs)成員之一參與多種腫瘤的發生發展。ROR2在肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌中表達下調,而在頭頸鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌和骨肉瘤中表達上調,表明ROR2的表達失衡與多種惡性腫瘤的發展密切相關。早期的研究已發現,在胰腺導管腺癌中,ROR2表達上調與患者預后不良相關[15],在乳腺癌中,ROR2蛋白表達增高則促進腫瘤細胞發生侵襲和轉移[16]。而在結直腸癌中,ROR2表達下調且可促進腫瘤細胞增殖和遷移[17]。以上研究結果表明,ROR2在不同惡性腫瘤中的發揮不同的功能。

ROR2在軟骨肉瘤中的確切功能尚不清楚。為探討ROR2在軟骨肉瘤發生發展中的作用,本研究使用軟骨肉瘤細胞系進行ROR2體外作用的研究。本實驗將ROR2-SiRNA及NC-SiRNA分別轉染入人軟骨肉瘤SW1353 細胞后,qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達變化,用以檢驗轉染效果。實驗結果顯示與空白對照組和NC組比較,ROR2-SiRNA組細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平均明顯降低,提示小干擾RNA成功轉染入人軟骨肉瘤SW1353 細胞且顯著抑制軟骨肉瘤細胞中ROR2的表達。CCK-8法檢測結果顯示與空白對照組和NC組比較,ROR2-SiRNA組中軟骨肉瘤細胞增殖受到明顯抑制,這一結果證實ROR2具有促進軟骨肉瘤細胞的增殖的作用。劃痕實驗及Transwell實驗結果顯示,與NC組比較,在抑制軟骨肉瘤細胞中ROR2的表達后,ROR2-SiRNA組中軟骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力明顯降低,表明抑制ROR2的表達能夠有效阻遏軟骨肉瘤細胞的遷移遷移和侵襲。

通過本研究的一系列實驗結果證實,靶向沉默ROR2的表達可以有效抑制軟骨肉瘤細胞的惡性生物學行為,提示ROR2在軟骨肉瘤中發揮促癌作用。

綜上所述,ROR2在軟骨肉瘤細胞中表達上調,靶向沉默ROR2表達可有效抑制軟骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究探索了軟骨肉瘤的發病機制并為后續軟骨肉瘤的治療提供了理論基礎。