隱丹參酮調節Sirt1/FoxO1信號通路對高糖誘導的腎小球內皮細胞損傷的影響

武文印, 武禹佳, 李 艷, 梁進穎

(1.河北省唐山市中醫醫院治未病科, 河北 唐山 063000 2.河北省唐山市豐潤區人民醫院, 河北 唐山 063000)

糖尿病腎病(DN)常見于糖尿病(DM)患者,約 30～40% 的DM患者會出現腎功能不全[1]。腎小球內皮細胞 (GEC) 是腎小球的固有細胞之一,作為腎小球濾過膜的第一道屏障,GECs與血液中的循環物質直接接觸,更容易受到葡萄糖、脂質和炎癥因子的破壞。DN 的特點是GEC損傷,GECs在DN的發生發展中起重要作用[2]。眾所周知,高血糖是通過誘導GEC功能障礙而導致 DN 發病最重要的危險因素之一[3]。因此改善高糖誘導的GEC損傷對于 DN 的治療很重要。隱丹參酮(cryptotanshinone,CT)是一種天然醌類化合物,Song等[4]發現,CT可促進 2 型糖尿病的傷口愈合,對炎癥、血管生成和細胞外基質重塑具有調節作用。但是關于CT對DN的影響尚未見報道。沉默信息調節因子1(Sirt1)/叉頭框蛋白O1(FoxO1)通路是重要的信號通路,被認為參與調節氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡 。Xu等[5]發現二甲雙胍可通過激活Sirt1/FoxO1自噬信號軸減輕DM大鼠腎損傷。是否CT可以通過調控Sirt1/FoxO1信號軸改善高糖誘導的GEC損傷我們進行了研究,以期為DN的治療提供數據參考。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑:人GEC(貨號:ABC-TC3783)購自上海啟達生物科技有限公司;CT(貨號:YG11560)購自上海韻泰信息科技有限公司;Sirt1/FoxO1信號通路抑制劑SIRT1-IN-1(貨號:HY-136199)購自MedChemExpress LLC;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(貨號:BY-B10110)上海白益生物科技有限公司;白介素-6(IL-6)(貨號:EKHU2643)、白介素-8( IL-8)(貨號:EKHU2645)購自迪信泰檢測科技(北京)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)(貨號:JKSJ--1821)、丙二醛(MDA)(貨號:JKSJ--1892)購自上海晶抗生物工程有限公司;MTT毒性和細胞活力試劑盒(貨號:M1020)購自北京雅安達生物技術有限公司;抗體:p-Sirt1(貨號:79-978)購自ProSci;Sirt1(貨號:E11-8476B )購自EnoGene;p-FoxO1(貨號:SAB4300094) 購自MilliporeSigma;FoxO1(貨號:bs-3142R)購自 Bioss;程序性死亡受體-1(Beclin 1)(貨號:3495)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3)(貨號:2775)、轉化生長因子β1 (TGF-β1)(貨號:3709 )、Bcl-2相關X蛋白(Bax)(貨號:2772)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)(貨號:9661)購自Cell Signaling Technology;Ⅰ型膠原(Col-I)(貨號:ab6308)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)(貨號:ab32124) 購自Abcam 。

1.2細胞毒性檢測:通過MTT法檢測CT的細胞毒性,將GEC接種在96孔板上(5×103個細胞/孔),培養24h后用不同濃度的CT(0、1、5、10、20、40μmoL/L)處理GEC 24h。然后每孔添加25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液,常溫孵育4h后,加入100μL/孔二甲基亞砜,震蕩后用酶標儀檢測OD570值。

1.3細胞培養及分組:將GEC于DMEM培養基培養(10%FBS),并將培養基放在37℃,5%CO2常規培養箱,當細胞融合率到70%,用胰酶消化、傳代培養。將GEC分為對照組(NR組,5mmoL/L D-葡萄糖)、高糖組(HG組,30mmoL/L D-葡萄糖)、L-CT組(1 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖處理GEC)、M-CT組(5 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖處理GEC)、H-CT組(10 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖處理GEC)和SIRT1-IN-1 組(10 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖+0.05moL/L Sirt1/FoxO1信號通路抑制劑SIRT1-IN-1處理GEC),培養24h后,收集GEC。

1.4MTT法檢測GEC增殖活性:取各組生長狀況較好的GEC培養24h后,使用MTT法檢測GEC細胞活性,操作步驟參考1.2。

1.5流式細胞術檢測GEC凋亡:取各組GEC,經離心后用PBS沖洗,與500μL結合緩沖液混勻,然后加入5μL AnnexinV-FITC孵育15min,2.5μL PI染液孵育5min,最后,在1h內用流式細胞儀分析GEC凋亡率。

1.6ELISA法檢測GEC培養上清液中炎性因子以及氧化應激指標水平:收集各組GEC培養液,置于4℃離心機以10000×g離心8min,分離上清液,參考ELISA試劑盒檢測炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)水平,以及氧化應激指標(SOD、MDA)水平。

1.7Western blot法檢測細胞中自噬、凋亡、纖維化因子和Sirt1/FoxO1通路相關蛋白表達:將RIPA裂解液與GEC混勻后提取總蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度后用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質,轉到PVDF膜上后用5%脫脂牛奶封閉1h,并與一抗Col-I (1∶1000)、TGF-β1(1∶1000)、Beclin-1(1∶500)、LC3(1∶500)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶500)、p-Sirt1(1∶1000)、Sirt1(1∶1000)、p-FoxO1(1∶500)、FoxO1(1∶1000)和GAPDH(1∶2,000),4℃下過夜。隨后加入二抗,ECL染液使蛋白可視化,Image J軟件使蛋白定量。

2 結 果

2.1CT對GEC毒性的影響:0～40μmoL/L CT對GEC無明顯毒性影響(P>0.05)。見表1。

表1 CT對GEC的毒性作用

2.2CT對GEC增殖活力的影響:與NR組相比,HG組OD570值顯著下降(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組OD570值顯著增大(P<0.05);SIRT1-IN-1組較H-CT組OD570值顯著減小(P<0.05),見表2。

表2 各組GEC的增殖活性比較

2.3CT對GEC凋亡水平的影響:與NR組相比,HG組GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著上調(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著下調(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05);SIRT1-IN-1組較H-CT組GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著上升(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05),見圖1-2,表3。

表3 CT對GEC凋亡率及凋亡相關蛋白的影響

圖1 流式細胞術檢測GEC凋亡

圖2 Western blot 檢測GEC凋亡相關蛋白

2.4CT對GEC培養上清液中炎性因子水平和氧化應激指標水平的影響:與NR組相比,HG組IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量顯著上升(P<0.05),SOD含量顯著下降(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組 IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量顯著下降(P<0.05),SOD含量顯著上升(P<0.05);SIRT1-IN-1 組較H-CT組IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量顯著增加(P<0.05),SOD含量顯著減少(P<0.05),見表4-5。

表4 CT對GEC炎性因子水平的影響

表5 CT對GEC氧化應激指標水平的影響

2.5CT對GEC自噬蛋白水平的影響:與NR組相比,HG組GEC Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平顯著下調(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組 Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平顯著上調(P<0.05);SIRT1-IN-1 組較H-CT組Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平下降(P<0.05),見圖3,表6。

圖3 Western blot檢測GEC Beclin1 LC3蛋白水平

表6 CT對GEC自噬蛋白水平的影響

2.6CT對GEC Col-I 和 TGF-β1蛋白水平的影響:與NR組相比,HG組GEC Col-I、TGF-β1蛋白水平顯著升高(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組Col-I、TGF-β1蛋白水平顯著下降(P<0.05);SIRT1-IN-1 組較H-CT組 Col-I、TGF-β1蛋白水平上升(P<0.05),見圖4,表7。

圖4 Western blot檢測Col-I 、TGF-β1蛋白水平

表7 CT對Col-I TGF-β1蛋白水平的影響

2.7CT對GEC Sirt1/FoxO1通路蛋白水平的影響:與NR組相比,HG組GEC p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比,L-CT組、M-CT組、H-CT組 p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平顯著升高(P<0.05);SIRT1-IN-1 組較H-CT組p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平降低(P<0.05),見圖5,表8。

圖5 Western blot檢測GEC Sirt1、FoxO1蛋白水平

表8 CT對Sirt1/FoxO1通路蛋白水平的影響

3 討 論

近年來,DM發病率持續上升,2015年全球共有4.15億人被診斷患有DM[1]。DN是糖尿病的常見并發癥,改善高糖誘導的GEC損傷是治療DN的有效途徑[3]。研究發現CT通過激活內質網應激介導的自噬抑制HCT116結直腸癌細胞的生長[6]。Lo等[7]發現CT可減輕I型糖尿病大鼠的心臟纖維化。近期發現,CT在抗糖尿病和抗肥胖方面起到改善作用[3]。因此,本研究猜測CT是否可以對高糖誘導的GEC損傷產生影響。

據報道,高葡萄糖通過促進線粒體中ROS的過度產生而引起氧化應激[8]。此外,過量生成的TNF-α、IL-6和IL-8被認為是高糖條件下導致DN組織損傷和纖維化的重要原因[3]。纖維化相關因子如Col-I和TGF-β1參與腎間質纖維化[9]。在正常血糖水平下,自噬是GEC的重要保護機制。自噬機制的下調,如在高血糖狀態下,可促進DN的發展和進展[10]。研究發現坦索羅辛可以抑制TNF-α、IL-6、IL-8含量以及Col-I和TGF-β1的表達,減輕高糖誘導的GEC損傷[3]。本研究結果顯示,與NR組相比,HG組OD570值、SOD含量、Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平顯著下降,GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、Col-I、TGF-β1蛋白水平,IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量顯著上調,CT處理后GEC增殖活性、自噬蛋白顯著升高,炎性反應、氧化應激及維化因子蛋白水平顯著下降,暗示CT可以激活高糖誘導的GEC自噬,減輕GEC炎性損傷以及氧化應激損傷。

SIRT1是NAD+依賴性脫乙酰酶的成員,內皮細胞中的SIRT1缺乏會促進氧化應激、炎癥,SIRT1也是自噬的促進劑,FoxO1是一種轉錄因子,涉及一系列細胞內功能,包括自噬、線粒體功能障礙和細胞凋亡[11]。Xu等[5]發現上調Sirt1/FoxO1信號軸可以緩解DM大鼠腎損傷。本研究結果顯示,與NR組相比,HG組p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平顯著降低,而CT使p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平顯著上調,暗示CT可以通過激活Sirt1/FoxO1信號軸激活細胞自噬以及細胞凋亡,進而緩解高糖誘導的GEC炎性損傷以及氧化應激損傷。本研究用Sirt1/FoxO1信號軸抑制劑和CT共同處理GEC,結果發現SIRT1-IN-1逆轉了CT對GEC的有利作用。

綜上所述,CT可以通過上調Sirt1/FoxO1信號軸激活自噬,減輕高糖誘導的炎性損傷、氧化應激損傷。本文不足是研究機制較淺,我們將在下步實驗深入研究。