高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸

黃程 葉小萱 董紅兵

摘 要：本研究考察乙醇、水、不同比例的乙醇-水溶液對(duì)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸3種防腐劑提取效果的影響，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)糕點(diǎn)中3種防腐劑的高效液相色譜法。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇∶水=40∶60（V∶V）時(shí)，3種防腐劑提取效果良好，并在0.20～50.33 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.999。3種防腐劑的檢出限為苯甲酸0.161 mg·kg-1、山梨酸0.160 mg·kg-1、脫氫乙酸0.160 mg·kg-1，平均回收率為93.16%～99.74%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為0.50%～4.00%。利用該方法對(duì)市售糕點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法基本一致，是一種方便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；糕點(diǎn)；防腐劑

Abstract： In this study， by comparing the extraction effects of ethanol， water and different proportions of ethanol-water solutions against benzoic acid， sorbic acid and dehydroacetic acid， a method was established to simultaneously detect these three preservatives in pastries using high performance liquid chromatography.The results showed that when ethanol∶water =40∶60 （V∶V）， the three preservatives had a good linear relationship between 0.20～50.33 μg·mL-1， and the correlation coefficients were all more than 0.999. The detection limits of the three preservatives were 0.161 mg·kg-1 for benzoic acid， 0.160 mg·kg-1 for sorbate and 0.160 mg·kg-1 for dehydroacetic acid. The average recoveries were 93.16%～99.74% with relative standard deviations （n=6） 0.50%～4.00%. This method is a convenient， fast and accurate method for the detection of commercial pastries， and the results are consistent with the national standard method.

Keywords： high performance liquid chromatography; pastries; preservatives

糕點(diǎn)是人們生活中的一款常見(jiàn)食品，主要以谷類(lèi)、薯類(lèi)、豆類(lèi)、油脂、糖和蛋等中的一種或多種為原料，按需添加其他輔料，經(jīng)過(guò)調(diào)制、成型、熟制等工藝制作而成，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。在糕點(diǎn)的制作過(guò)程中，為了延長(zhǎng)其貨架期，人們可能會(huì)添加食品防腐劑，以增加糕點(diǎn)的商業(yè)價(jià)值[2]。目前，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等防腐劑的使用在食品中屢見(jiàn)不鮮[3]。防腐劑主要是通過(guò)抑制食品中微生物的生長(zhǎng)與繁殖達(dá)到防腐效果。苯甲酸是人們使用較早的一類(lèi)酸性食品防腐劑，使用歷史較長(zhǎng)，過(guò)量攝入會(huì)影響人體血壓、心臟、腎臟功能。研究表明，對(duì)大鼠肝腎多次給藥苯甲酸鈉，對(duì)肝臟造成了一定的損害[4-8]。山梨酸是很多國(guó)家的首選防腐劑，具有超高的安全性，但是過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響[9]。脫氫乙酸是一種廣譜高效的食品防腐劑，受到各類(lèi)食品企業(yè)的普遍歡迎，被廣泛應(yīng)用于奶油、面包、蛋糕等糕點(diǎn)中[10-11]。

目前，對(duì)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸檢測(cè)方法的研究很多，但以乙醇-水溶液作為提取溶劑，結(jié)合液相色譜測(cè)定的方法研究較少[12-15]。苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測(cè)主要采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）[16]和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）[17]中規(guī)定的方法。檢測(cè)一份樣品中不同防腐劑的含量需分開(kāi)檢測(cè)，增加了工作量，加大了工作難度，降低了檢測(cè)效率，且成本普遍較高，因此建立一種可以同時(shí)檢測(cè)多種防腐劑的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糕點(diǎn)樣品購(gòu)買(mǎi)于本地超市。苯甲酸（99.66%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）；山梨酸（99.18%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）；脫氫乙酸（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)merck公司）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅和氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；TGL-205離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各20 mg于10 mL容量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇溶解后，定容至10 mL刻度線處，配制成濃度為2 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別移取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL于10 mL容量瓶中，以無(wú)水乙醇定容，配制成濃度為200 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g粉碎均勻的樣品放入離心管中，加入20 mL提取溶劑，渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120A C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30.0 ℃；流動(dòng)相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸銨溶液=13∶87（V∶V）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

1.3.4 提取溶液的選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取空白樣品2 g于50 mL離心管中，分別添加10 μg、20 μg、40 μg（n=3）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混勻，加入20 mL乙醇-水溶液（乙醇濃度為0%、20%、40%、50%、60%和80%，V∶V），渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液，得待測(cè)液。高效液相色譜測(cè)定待測(cè)液中的防腐劑，計(jì)算3種防腐劑的回收率。

1.3.5 方法驗(yàn)證

①測(cè)定線性范圍及檢出限。將苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，以3種防腐劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積大小為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②加標(biāo)回收試驗(yàn)。取空白糕點(diǎn)樣品18份，每份約2 g，分別添加10 μg、20 μg、40 μg（n=3）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20 mL 1.3.4確定的提取溶液，按1.3.2樣品前處理方法處理樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算各組分的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。③精密度試驗(yàn)。質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇結(jié)果

由圖1知，3個(gè)添加水平下，當(dāng)提取溶液中乙醇濃度逐漸升高時(shí)，苯甲酸和山梨酸的回收率均較高且相差不大；在100%乙醇作為萃取溶劑時(shí)，回收率下降明顯。脫氫乙酸在乙醇含量高于50%時(shí)，回收率開(kāi)始下降，隨提取液中乙醇濃度的提高不斷下降，尤其是在10 μg加標(biāo)濃度下。且當(dāng)提取液中乙醇含量超過(guò)60%時(shí)，脫氫乙酸的色譜峰由尖峰變?yōu)轳劮澹痉椒ㄌ崛∪軇┲幸掖急壤龑?duì)脫氫乙酸影響較大。綜合考慮，選擇40%乙醇溶液，即40%的乙醇-水溶液作為提取溶劑。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 線性范圍及檢出限

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸在0.20～50.33 μg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)＞0.999。以S/N=3計(jì)算檢出限，以S/N=10計(jì)算定量限，當(dāng)取樣量為2 g時(shí)，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的最低檢出限為0.161 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1，定量限為0.403 mg·kg-1、0.400 mg·kg-1、0.399 mg·kg-1，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

從表2可看出，3種防腐劑的平均回收率為93.16%～99.74%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%～4.00%，表明方法回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，誤差在可接受范圍之內(nèi)。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和空白樣品加標(biāo)色譜圖如圖2所示，3種防腐劑出峰順序?yàn)楸郊姿帷⒚摎湟宜帷⑸嚼嫠幔Ａ魰r(shí)間在7.3 min、8.9 min、9.7 min左右，3種防腐劑色譜峰峰形良好，峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，可完全分離，且樣品中雜質(zhì)對(duì)色譜峰無(wú)干擾。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

由表3可知，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的RSD為0.51%、0.21%和0.59%，具有良好的精密度。

2.3 樣品的測(cè)定結(jié)果

用建立的方法測(cè)定市場(chǎng)銷(xiāo)售的5批次糕點(diǎn)中3種防腐劑的含量，并與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。本實(shí)驗(yàn)方法所測(cè)定的實(shí)際樣品中的防腐劑含量與國(guó)標(biāo)方法測(cè)定樣品中防腐劑含量基本相符，本實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果可靠，適用于糕點(diǎn)中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸3種常用防腐劑的同時(shí)檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究選取乙醇-水溶液作為提取溶劑，利用高效液相色譜法建立了一種檢測(cè)糕點(diǎn)中多種食品防腐劑的方法，考察了該方法的線性范圍、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和精密度等，將檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明該方法具有快速、簡(jiǎn)便、高效的優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，可以為糕點(diǎn)中多種防腐劑的測(cè)定提供依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（B2022289）。

作者簡(jiǎn)介：黃程（1986—），女，湖北武漢人，碩士，助教。研究方向：食品檢測(cè)與分析。