活性氧/活性氮與NF-κB信號通路級聯交互在肝纖維化中的作用

閔遠騫, 李 姍, 劉湘花, 楊 藝, 李寧寧, 祿保平

1 河南中醫藥大學 a.第二臨床醫學院, b.醫學院, c.中醫藥科學院, d.肝病研究中心, 鄭州 450046; 2 河南醫學高等專科學校, 鄭州 451191

肝纖維化是由于各種致病因子破壞肝細胞,導致的肝臟組織結構異常增生,是多種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌轉化的必經病理過程。活性氧/活性氮(ROS/RNS)作為氧化應激的產物,是近年來肝纖維化研究的熱點之一,其通過細胞內外作用產生,是參與細胞生長、分化、衰老和凋亡的信號介質[1]。當氧化和抗氧化失調,就會造成ROS/RNS產生過多或清除不足并誘導細胞毒作用,造成肝臟脂質、蛋白質和DNA過氧化損傷,進而促進或加重肝纖維化[2]。NF-κB信號通路是調控炎癥的重要通路之一,在多種慢性肝病發生發展中發揮關鍵的調控作用[3]。本文圍繞ROS/RNS與NF-κB級聯交互關系及其在肝纖維化中的重要作用進行綜述,以期為基于ROS/RNS與NF-κB信號通路的肝纖維化靶向治療提供策略和參考。

1 ROS/RNS與肝纖維化

1.1 ROS/RNS 機體內正常代謝可以產生ROS/RNS,在生理狀態下它們的產生與清除動態平衡。其中ROS是體內含氧化合物的總稱,主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等[4]。而RNS是高氧化活性自由基和硝基類化合物的總稱,包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等[5]。ROS的來源大致可分為兩大類:第一類是內源性生物過程,主要由線粒體的八個部位氧化代謝,釋放ROS,作為各種必要反應的副產品或廢物;第二類是外源性物質的反應過程,細胞因子及細菌入侵,在分子合成或分解過程中產生ROS,作為信號傳輸的一部分[1]。ROS還可產生細胞分隔,作為決定氧化還原信號傳導或氧化損傷的關鍵,保證信號傳導與物質代謝相互調節[6]。正常情況下,RNS是由線粒體在低氧狀態下產生的,而在炎癥過程中引發的氧化爆發期間,免疫系統的細胞會產生超氧陰離子和NO,二者反應產生大量更具氧化活性的分子,在該條件下RNS會過量產生導致亞硝化反應,從而改變蛋白質結構,抑制其正常功能[7]。大多數實驗證據表明,低水平的ROS/RNS不會影響線粒體的形態或誘導絲狀化,而過高的ROS/RNS水平不能被細胞的抗氧化防御系統平衡[8],會導致氧自由基數量增多,這些自由基作用于細胞膜脂,氧化應激反應被放大,進一步刺激炎癥細胞激活,造成氧化應激與炎癥反應之間正相關式的惡性循環[9]。

1.2 ROS/RNS參與肝纖維化 肝臟的免疫細胞、肝星狀細胞(HSC)、肝細胞、肝竇內皮細胞均可產生ROS/RNS,其主要來源于線粒體呼吸鏈、黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶(NOX)、脂質過氧化物酶、細胞色素p450酶、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等多種酶系統的催化。ROS/RNS既可以直接參與肝纖維化發生,也可通過其他病理過程介導肝纖維化發生發展[10]。現已證實,肝炎病毒、酒精、脂多糖、膽汁淤積等均可刺激肝細胞表達NOX1、NOX2和NOX4,催化ROS產生并誘導肝細胞凋亡及Kupffer細胞激活,凋亡的肝細胞分泌TGF-β、TNF-α、PDGF、EGF等促纖維化分子,肝Kupffer細胞通過自分泌或旁分泌產生TGF-β、TNF-α、IL-6、IGF等促炎因子或促纖維化分子,通過TGF-β/smad、NF-κB等信號通路級聯反應,造成肝臟氧化應激水平升高,刺激HSC活化增殖,促進膠原合成增加,介導纖維化發生[11]。此外,活化的HSC 表達NOX1、NOX2、iNOS增加,ROS/RNS產生進一步增加,TGF-β/smad、MEK/ERK、PI3K/AKT等信號通路激活,誘導肝細胞凋亡并加重肝損傷[12-13]。在肝纖維化發生過程中,ROS/RNS相互協同或拮抗發揮作用[14]。研究[15]表明ROS可激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥體,誘導慢性炎癥和纖維增生,導致HSC活化,最終促進纖維化。Zhang等[16]用野生型和ERKO小鼠肝纖維化模型,證明柴胡皂苷d可通過激活ERβ通路負性調節ROS/NLRP3炎癥小體,從而減輕肝纖維化。Yi等[17]證實了小檗堿通過抑制自噬,提高ROS水平,增強鐵蛋白降解,誘導HSC鐵死亡,驅動HSC鐵下垂以減輕肝纖維化。Gan等[18]應用NOX抑制劑干預CCl4誘導的肝纖維化模型后,發現其對肝細胞TGF-β1信號表達有明顯抑制作用,可通過此降低ROS/RNS表達減少炎癥反應,減輕肝纖維化。Chung等[19]用NecroX-7通過抑制全細胞ROS/RNS和炎癥反應,來改善小鼠NASH模型的肝臟脂肪變性和纖維化。上述研究表明ROS/RNS參與肝纖維化進程,是肝纖維化發生發展中的重要一環。

2 NF-κB與肝纖維化

2.1 NF-κB NF-κB屬Rel蛋白家族,主要由 c-Rel、RelB、p65、p50和p52構成,是經典的細胞核轉錄因子,被稱為NF-κB/Rel蛋白家族。其中,p65與p50廣泛存在于人體中,發揮著主要生理作用,p65的C末端具有活化NF-κB所需的反式激活域,對表達起正調節作用,而p50不存在轉錄激活區域,可以抑制轉錄[20]。NF-κB在未激活狀態時,與IκB蛋白共同靜息存在,參與體內大部分炎癥反應的調控。當受到外源信號如紫外線、藥物、壓力等刺激時,IκB 蛋白的絲氨酸被磷酸化,促使IκB 蛋白降解,從而刺激NF-κB釋放進入細胞核,調控多種mRNA轉錄,此為NF-κB激活的經典信號途徑;而其并不是唯一途徑,某些不依賴IKK復合物激活的胞外信號刺激,通過 MyD88 蛋白與下游 TRAF6 連接并相互作用,使TRAF6二聚化,對于免疫應答同樣重要,屬于非經典信號途徑[20-22]。

2.2 NF-κB調控肝纖維化 NF-κB活性受到嚴格調控,其失控與否對于機體平衡狀態有重要影響,可導致多種疾病發生,肝臟疾病也是其中的一種,而肝纖維化屬慢性肝病進程中的病理變化[22]。肝損傷時,NF-κB誘導型激酶表達增多,NF-κB信號通路活化,激活巨噬細胞促使其釋放多種炎癥細胞因子、趨化因子、促凋亡分子,觸發肝臟炎癥反應并誘導肝細胞凋亡[23]。肝Kupffer細胞作為特殊的巨噬細胞,在肝臟炎癥時釋放大量自由基產物促進細胞漿中的IκBα降解和NF-κB的亞基p65和p50核轉錄,使得NF-κB持續活化,活化的NF-κB刺激巨噬細胞分泌促炎因子[24](如IL-1β、IL-6等)和促纖維化分子,活化并募集HSC至損傷部位,導致肝纖維化形成[25]。馬良等[26]對130例乙型肝炎肝硬化患者的TLR4、MyD88、NF-κB的水平進行分析,得出這三項的變化情況與肝臟疾病的病理進程相關,相較于正常人來說,呈明顯的過度表達,也就是說肝纖維化發生與NF-κB表達呈正相關。肝纖維化時NF-κB活性增強,以致炎癥反應持續發生,促炎因子誘導炎細胞浸潤,使得正常肝細胞持續損傷,加重肝纖維化程度。崔東來[27]通過應用小分子干擾RNA技術抑制NF-κB p65基因,證明抑制NF-κB活性的藥物可促進HSC凋亡,逆轉實驗性肝纖維化,減少細胞外基質合成,起到抗肝纖維化的作用。由此來說,尋求抑制NF-κB活性的方法,對于防治肝纖維化發生及發展有切實可行的作用。陳建勇等[28]對60只肝纖維化SD大鼠模型,應用卡維地洛干預后的變化情況做了比較記錄,發現該藥物可以使NF-κB蛋白表達水平逐漸降低,達到抑制肝臟炎癥反應和肝纖維化進展的作用。朱凈等[29]將32只SD大鼠隨機分成對照和模型兩組,用CCl4誘導肝纖維化模型,發現NF-κB在正常大鼠的肝組織中僅有少量表達,在CCl4注射后表達水平隨注射周期和纖維化程度不斷增加,進一步提示NF-κB在肝纖維化過程中的重要作用。

3 ROS/RNS與NF-κB通路在肝纖維化中的級聯交互

外源性與內源性因素刺激肝臟,導致肝臟內氧化與抗氧化狀態失衡,發生氧化應激,造成ROS/RNS產生過多,啟動NLRP3炎性小體,促使炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α等的表達,這些因子的表達可刺激位于TLR4下游信號通路連接處的NF-κB活化,而活化的NF-κB又會導致IL-1、IL-6和TNF-α等的增加和ROS/RNS的積聚。所以當肝細胞壞死或凋亡時,炎癥反應與氧化應激相互影響,NF-κB信號通路激活與多種炎癥因子表達相互影響,促使ROS/RNS產生并大量蓄積,升高肝臟氧化應激水平,加重肝細胞損傷并誘導HSC激活[7],以膠原為主的細胞外基質大量沉積在肝組織內,促使纖維化形成[30]。上述聯系形成了循環影響、相互連帶的級聯交互關系(圖1)。研究表明,具有抗氧化作用的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)可通過清除過氧化氫、羥自由基、NO、二氧化氮等自由基而抑制肝纖維化。因此,ROS/RNS與NF-κB之間級聯交互關系對于肝纖維化防治起重要的指導作用,抑制兩者交互則可控制正常肝細胞向肝纖維化發展的進程。可以通過抑制NF-κB信號通路激活,來恢復氧化與抗氧化失衡的狀態,降低炎癥反應發生;也可通過抑制炎癥反應,平衡氧化與抗氧化水平,來降低對NF-κB的過度激活,減輕肝纖維化程度。

圖1 ROS/RNS與NF-κB信號通路的級聯交互Figure 1 The cross-link between ROS/RNS and NF-κB signaling pathway

馮曉異等[31]應用三七總皂苷治療非酒精性脂肪肝大鼠,發現其可以有效降低肝組織NO、iNOS水平,以及NF-κB信號通路的表達,從而達到減輕炎癥反應及緩解肝臟損傷的作用。Tang等[32]觀察了山奈素對高脂飲食誘導肝纖維化的干預作用,發現山奈素可通過降低TLR4的表達水平,抑制NF-κB信號通路的激活,減少MCP-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的產生,減輕肝細胞損傷和ROS/RNS的產生,具有抗纖維化作用。Liu等[33]研究發現知母皂苷可以下調p-NF-κB的蛋白水平并上調Nrf2/HO-1的蛋白水平,減輕肝組織的氧化損傷,有效阻斷肥胖大鼠的炎癥和血脂異常。Li等[34]應用NAFLD大鼠模型研究發現,橙皮素可以通過激活PI3K/AKT-Nrf2信號通路,降低ROS的產生,抑制NF-κB介導的炎癥,減輕纖維化程度。Chen等[35]對硫代乙酰胺(TAA)誘導的肝纖維化小鼠給與脫落酸干預治療,發現治療組小鼠肝組織勻漿中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和I型膠原顯著減少,丙二醛(MDA)降低, GSH和CAT增高,其可能是通過抑制NF-κB信號通路發揮抗炎、抗氧化損傷和抗肝纖維化的功效。Rodríguez等[36]的研究發現Maresin-1具有治療二乙基亞硝胺誘導的肝纖維化的作用,其機制可能與抑制NF-κB p65的核轉移,降低TGF-β及其受體水平,減少ROS產生,減輕炎癥反應有關。Zaghloul等[37]應用黃芩苷治療TAA誘導的肝硬化大鼠,結果顯示黃芩苷可減少促炎因子形成,降低NF-κB信號通路對炎癥反應的驅動,通過抗氧化能力靶向調控炎癥,發揮抗纖維化功效。除上述列舉文獻外,還有很多研究者[38-42]開展了相關實驗,均發現ROS/RNS、NF-κB與肝纖維化發生發展密切相關(表1)。

表1 肝纖維化時ROS/RNS與NF-κB級聯交互作用相關文獻回顧Table 1 Literature review of the cross-link between ROS/RNS and NF-κB signaling pathway in liver fibrosis

4 總結與展望

ROS/RNS是細胞正常代謝的產物,被認為是控制生物體各種正常生理功能的第二信使。而病理的氧化應激狀態,氧化與抗氧化系統失衡,會使ROS/RNS大量堆積,直接激活HSC,產生導致纖維化的細胞外基質或誘導肝細胞炎癥。ROS/RNS在NF-κB信號通路的激活中發揮核心作用,可促使激活所需的IκB激酶與IκBα磷酸化,而后NF-κB移位到細胞核中被激活。NF-κB信號通路的激活導致炎癥因子釋放,氧化應激水平升高,氧化自由基增多,失去原有的動態平衡,肝纖維化形成。近年來多項研究表明具有直接或間接抗氧化活性的化合物,可清除自由基或改善氧化應激狀態,預防或減輕實驗性肝纖維化的發生發展。抑制NF-κB信號通路亦能改善氧化應激和炎癥反應,從而調控肝纖維化的進程。據此,可以利用ROS/RNS與NF-κB信號通路的交互作用,通過采取措施調節氧化還原穩態、抑制NF-κB信號通路的激活,來緩解甚至阻止患者纖維化。因此,還需深入研究ROS/RNS與NF-κB信號通路級聯交互的分子機制,探索逆轉肝纖維化發生發展的特效靶向藥物,為改善肝纖維化提供依據和幫助。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明:閔遠騫負責撰寫論文及繪制圖片;李姍負責課題設計及修改論文;李寧寧、劉湘花、楊藝負責文獻檢索及整理;祿保平負責擬定寫作思路及最后定稿。