百里醌對化學誘導的潰瘍性結腸炎的保護作用

吳 磊, 李廣瑩, 閆永平, 肖桂然

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

腸炎是目前全球范圍內發病最多、分布最廣泛的疾病之一,嚴重影響人們的健康、生活和工作,給個人、家庭和社會帶來嚴重的經濟負擔。炎癥性腸病是指以胃腸道慢性炎癥為特征的克羅恩病(Crohn disease)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)2種疾病。克羅恩病導致胃腸道任何部分的跨壁潰瘍,最常影響回腸和結腸的末端。UC包括結腸黏膜的彌漫性炎癥,最常累及直腸(直腸炎),但也可能延伸至乙狀結腸(直乙狀結腸炎)、超出乙狀結腸(遠端潰瘍性結腸炎)或包括整個結腸進入盲腸(全結腸炎)[1]。如果炎癥性腸病治療不徹底,那么可能會引起消化吸收功能差、營養不良、腸黏膜潰瘍引起出血等諸多后果。近年來,國內外醫學界越來越重視對腸炎的診療,許多研究者都對腸炎診療方案進行優化和推陳出新。調查研究顯示,飲食不當在促進腸炎發生發展中起到關鍵性作用。研究發現,有些人類膳食中的活性成分對腸炎具有良好的防治作用,其機制與抗炎、抗氧化、免疫調節等有關[2]。因此尋找并研究這類活性物質意義重大。

毛茛科一年生草本植物黑種草種子常用于傳統醫療各種疾病,如胃腸道疾病、頭疼、高血壓、支氣管哮喘等疾病[3]。百里醌(thymoquinone, TQ)是從黑種草種子中提取的活性物質,化學名稱為2-異丙基-5-甲基-1,4-苯并醌,分子式為C10H12O2。研究發現TQ具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等作用,對正常細胞毒性很小[4],可用于多種疾病的治療,例如TQ能夠抑制由乙酸誘導的大鼠結腸炎[5],治療實驗性風濕性關節炎[6],抑制鼠膿毒性腹膜炎[7]。

果蠅是遺傳和發育研究中重要的模式生物之一,其特點是生長發育周期短,飼養方便,其組織與器官結構與哺乳動物相對應,例如其中腸與哺乳動物的小腸類似,其馬氏管與腎臟類似[8]。果蠅已被應用于帕金森、阿爾茲海默癥、腫瘤、炎癥等多種疾病的研究中,并取得顯著成果。

目前,多種動物實驗模型被廣泛用于研究炎癥性腸病的病因、發病機制及測試新開發藥物藥效等,尤其以葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導的UC模型應用最廣。DSS誘導的果蠅腸炎模型的病因、臨床癥狀、病理改變及治療效果均與人類UC相似,可用于研究UC病因、發病機制[9]。腸道上皮是抵御環境壓力(包括有毒化學物質)的重要防御系統,腸道完整性的破壞是多種腸道疾病的主要原因之一[10]。TQ已被證實在放射性射線誘導的腸屏障破壞中起保護作用[11],然而,其對有毒化合物誘導的炎癥的防御效果研究不多。本研究利用DSS誘導的果蠅UC模型,探究有毒化學物質誘導腸炎的機制,并從營養的角度探討TQ對有毒化學物質誘導的腸道破壞的保護作用,研究結果為天然物質預防及治療炎癥性腸病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

野生型果蠅W1118購于維也納果蠅中心(ViennaDrosophilaResearch Center);DSS、亮藍購于上海麥克林生化科技股份有限公司;TQ購于美國Sigma;其他試劑均為分析純。

酶標儀(澳大利亞INFINITE MNANO);倒置熒光DIC顯微鏡(日本Nikon);超敏化學發光成像系統(美國ProteinSimple公司)。

1.2 果蠅培養及壽命測定

在25 ℃、60%濕度下,光照12 h、黑暗12 h循環培養。對照組在玉米酵母標準食品上培養。

黑腹果蠅在25 ℃、60%濕度下進行12 h/12 h光/暗循環培養。24 h內采集新羽化成蠅。每2～3 d將50只成蟲培養并轉移到裝滿新鮮食物的新瓶子中。每天統計存活蠅數,實驗重復3次。

1.3 以DSS構建果蠅腸炎模型

將W1118野生型果蠅隨機分為對照組和實驗組,對照組給予果蠅正常食物(normal food,NF),實驗組在果蠅的膳食中加入一定濃度TQ,挑2組果蠅子一代,將子一代果蠅分別給予5% 蔗糖(SUC)、5%SUC+4%DSS處理,構建果蠅腸炎模型。

1.4 存活率的測定

以NF或含TQ的食物飼養3～5 d的新羽化果蠅(雌、雄各30只),饑餓2 h,轉移到含有5%SUC+4% DSS毒性化合物的2層濾紙的小管中。所有實驗均以不添加DSS的5%SUC溶液為陰性對照。濾紙和溶液每24 h更換1次。每天更換濾紙,監測存活率。實驗重復3次。

1.5 攀爬能力的測定

在溫度為25 ℃、濕度為60% 的環境光下進行實驗。10只新羽化(3日齡)的果蠅喂食添加或不添加DSS(4%)的SUC(5%)溶液24 h。用足夠的力量將果蠅移到內底面,用非常輕的力度反復敲擊圓柱體上的封閉泡沫墊。每次實驗從最后一次拍打果蠅開始,持續6 s,并統計超過8 cm高度的果蠅數量。實驗重復3次。

1.6 果蠅腸道形態和通透性的測定

10只新羽化的(3日齡)雌蠅暴露于4%DSS 72 h,在1×PBS中解剖,立即在熒光顯微鏡下觀察并記錄腸道形態。

為了評價添加TQ對腸道通透性的影響,將果蠅分別飼喂TQ(100 μmol/L)和NF作為實驗組與對照組。添加亮藍制成質量分數為2.5%的染色培養基,將實驗組與對照組新羽化的雌蠅每隔1 d饑餓2 h,用濾紙浸泡DSS/SUC溶液處理6 h,然后將果蠅轉移到亮藍染色的食物中,處理7 d后拍攝記錄果蠅身體狀態。

1.7 數據統計與分析

所有數據的統計分析和圖形顯示均使用GraphPad Prism 8.0進行。組間比較采用t檢驗,多組采用單因素方差分析(ANOVA)。統計結果以(平均值±標準差)表示。顯著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P< 0.001(***)。

2 結果與分析

2.1 TQ對野生型果蠅壽命的影響

環境壓力和氧化壓力是導致組織穩態下降和功能退化的主要原因,也加速了黑腹果蠅的衰老[12]。據報道,TQ具有抗氧化能力。為了驗證TQ對氧化應激損傷的緩解作用,本文研究TQ對黑腹果蠅壽命的影響,如圖1所示。

圖1 TQ 對野生型果蠅壽命的影響

為了研究TQ對黑腹果蠅的影響,野生型果蠅W1118在標準玉米粉培養基含或不含TQ(100 μmol/L)上飼養,發現長期喂食TQ顯著提高了雌、雄果蠅的壽命,分別比對照組提高11.3%和9.8%,顯著延長了果蠅壽命。

2.2 TQ對攝入DSS果蠅存活率的影響

DSS誘導的UC可損傷成蠅的腸道,使黑腹果蠅的存活時間縮短,如圖2所示。由圖2可知,與NF-DSS組相比,添加TQ(100 μmol/L)可顯著提高DSS組的存活率;TQ-DSS組與NF-DSS組相比,雌、雄果蠅存活率分別提高了12.5%和20.0%。

圖2 TQ對UC模型果蠅存活率的影響

2.3 TQ對攝入DSS果蠅攀爬能力的影響

攀爬能力是衡量果蠅活力的一個指標。TQ對攝入DSS果蠅攀爬能力的影響如圖3所示。

圖3 TQ對UC模型果蠅攀爬能力的影響

由圖3可知,經DSS處理48 h后,NF-DSS組果蠅攀爬能力較NF-SUC組顯著降低(雌性下降75%,雄性下降29%);添加TQ提高了攀爬能力(雌性提高41%,雄性提高22%)。結果表明,TQ能挽救因有毒化學物質而降低的攀爬能力。

2.4 TQ對UC模型果蠅腸道形態的影響

DSS誘導的黑腹果蠅腸道損傷可引起腸道形態的改變,如圖4所示。由圖4可知,DSS(NF-DSS)處理果蠅的腸道長度比蔗糖對照(NF-SUC)短23%。與對照組(NF-DSS)相比,TQ-DSS組腸道長度延長13%。因此,TQ可改善因DSS誘導產生的腸道形態變化。

圖4 TQ對UC模型果蠅腸道形態的影響

2.5 TQ對UC模型果蠅腸道通透性的影響

果蠅腸道屏障功能的喪失可以通過一種名為亮藍的不可吸收的藍色食用染料檢測,當腸道通透性增加時,亮藍會透過腸上皮從而浸染全身。為了研究TQ在維持腸道屏障完整性方面的作用,本文使用亮藍實驗評估果蠅的腸道完整性,結果如圖5所示。

圖5 TQ 對UC模型果蠅腸道通透性的影響

由圖5可知,與NF-SUC組相比,DSS處理后,身體藍色染色增加,補充TQ后,TQ-DSS組的果蠅身體藍色染色明顯下降。結果表明,TQ對DSS引起的腸屏障功能破壞具有保護作用。

3 結 論

TQ是一種從黑種草種子中提取的活性單萜分子,已被證實具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎癥等功能。雖然TQ的藥理作用已被廣泛研究和證實,但其對腸道炎癥治療的作用卻鮮有報道。腸上皮細胞是維持腸內環境穩定的重要屏障,許多腸道疾病都與腸上皮細胞的凋亡有關,包括由有毒化學物質引起的潰瘍性腸炎。本文通過飼喂果蠅DSS建立腸道損傷模型,從壽命、存活率、攀爬能力、腸道形態、腸道通透方面探討TQ對有毒化合物所致UC的治療效果。研究發現,TQ可以提高果蠅成蟲的壽命,并顯著緩解DSS暴露后成蟲存活率及攀爬能力下降和腸道形態受損的情況,表明TQ對腸道疾病有保護作用,為天然物質預防及治療炎癥性腸病提供參考。