基于濾紙片上浮法探究pH和底物濃度對H₂O₂酶促反應的影響

董路遙 王穎 張志祥

摘要 優(yōu)化教材實驗“探究 pH 對H2O2酶活性的影響”，并測量了不同濃度的H2O2底物對酶促反應的影響，利用濾紙片上浮法測定酶促反應速率，簡化實驗步驟、放大實驗現(xiàn)象，提高了實驗成功率。結果顯示：H2O2酶的最適 pH在6.0左右，pH2.0環(huán)境下其活性完全喪失，pH10.0環(huán)境下活性降低且重新置于適宜 pH 環(huán)境后可部分恢復。一定范圍內(nèi)，酶促反應速度與 H2O2濃度呈正比。

關鍵詞? 濾紙片上浮法酶活性 H2O2酶

中圖分類號 G633.91???????????? 文獻標志碼 B

文件編號：1003-7586（2023）03-0070-03

“探究 pH 對 H2O2酶活性的影響”是人教版《必修1·分子與細胞》中“降低化學反應活化能的酶”的重要實驗，但教材只提出使用 H2O2酶和 H2O2作為實驗材料，未具體說明實驗如何操作、氣體如何收集等問題。浙教版教材則利用排水法收集氣體，通過不同 pH 下 O2釋放量來表征酶活性大小。然而，學生在實際操作中常會出現(xiàn)濾紙片粘貼不牢、氣體收集困難、組間現(xiàn)象差異不明顯等問題，實驗成功率較低。

為使學生觀測到更明顯的實驗現(xiàn)象，以人教版教材“葉圓片上浮法探究光合作用強度”實驗為基礎，將 H2O2酶通過吸附法固定在圓形濾紙片上，利用濾紙片上浮法探究酶促反應速率。相比于排水集氣法，濾紙片上浮法將O2的生成速度轉(zhuǎn)化成濾紙片上浮速度，學生通過錄制視頻就能實現(xiàn)對多組實驗結果的觀察記錄，同時也能克服由于裝置氣密性、學生集氣熟練度等因素帶來的干擾。并且濾紙片形狀固定，材質(zhì)統(tǒng)一，可吸附的酶量相對恒定，實驗的平行性較好，可重復性強。

1 材料與方法

1.1制備磷酸緩沖液和 H2O2溶液

將0.2 mol/L 磷酸二氫鈉、0.2 mol/L 磷酸氫二鈉和蒸餾水按一定比例配制成 pH 為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0和10.0的磷酸緩沖液。將30%的 H2O2原液分別用蒸餾水稀釋至1.5%、2%和3%。

1.2酶的提取和固定化

將200 g 馬鈴薯和400 mL 20 mmol/L 磷酸二氫鉀置于破壁機中榨汁并過濾，濾液即為粗酶液。向含粗酶液的培養(yǎng)皿中投入直徑為1 cm 的圓形濾紙片，浸泡1 min，然后夾起濾紙片，靠在潔凈的試管壁上。

1.3酶促反應的測定

1.3.1不同pH對H2O2酶活性的影響

取5個200 mL 規(guī)格的燒杯編號1～5，分別倒入50 mL pH 為4.0～8.0的磷酸緩沖液，再倒入等量1.5% H2O2溶液。向各燒杯中輕輕放入8片含酶濾紙片并用秒表計時。觀察濾紙片在燒杯內(nèi)的位置變化，記錄每片濾紙片從入水到出水的全部時長。

1.3.2不同濃度的H2O2對酶促反應速率的影響

取3個200 mL 燒杯編號Ⅰ～Ⅲ，分別倒入50 mL 1.5%、2%和3%的 H2O2溶液，再倒入等量 pH 為6.0的磷酸緩沖液，向各燒杯中加入8片含酶濾紙片，記錄濾紙片的上浮時長。

1.3.3探究過酸或過堿對酶的影響是否可逆

取5個200 mL 燒杯編號 A～E，向各燒杯中均加入50 mL pH 為6.0的緩沖液和50 mL H2O2溶液。將含酶的濾紙片平均分為五組（每組8片），分別編號為a～e組，如表1進行相關操作。接著，將a～e組濾紙片依次倒入 A～E 號燒杯中，記錄每片濾紙片上浮時長。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel計算每組濾紙片上浮的平均時間及標準差，并繪制曲線圖和柱形圖。

2 結果與分析

2.1不同 pH 對H2O2酶活性的影響

由表2可知，22.3 s 時，pH 6.0組的濾紙片率先上浮，其余組的第一片濾紙片也在接下來的2～4秒內(nèi)上浮。在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，隨著pH 上升，濾紙片上浮的時間先下降后上升，說明 H2O2酶活性先升高后下降，當pH為6.0時，濾紙片上浮時間最短，因此H2O2酶的最適pH在6.0左右。

基于實驗數(shù)據(jù)，學生利用 Excel 軟件繪制上浮時間-pH 曲線圖（圖1），在提高數(shù)據(jù)處理能力的同時，通過認別坐標圖中橫縱坐標含義、曲線趨勢等關鍵圖表元素增強了學生的識圖分析能力和邏輯推理能力，這為深入分析pH對酶活性的影響奠定了基礎。

2.2不同 H2O2濃度對反應速率的影響

當 H2O2濃度為1.5%-3%時，濾紙片上浮時間與 H2O2濃度成反比，即 H2O2濃度越高，酶促反應速度越快（圖2）。這是因為當?shù)孜餄舛容^低時，酶分子的活性中心未被底物全部飽和，所以隨著底物濃度的增加，反應速率逐漸增大。

2.3探究過酸或過堿對酶的影響是否可逆

隨著實驗的深入，有學生提出疑問：將過酸過堿條件下的酶重新置于最適 pH，其活性能否恢復？為進一步研究酶的作用機理，學生組建興趣小組，增設了一組拓展實驗。

表3數(shù)據(jù)顯示：（1）含酶濾紙片經(jīng)pH為2.0的緩沖液處理后未上浮，恢復至最適pH后也未能浮起。（2）含酶濾紙片經(jīng) pH 為10.0的緩沖液處理后仍有少量上浮，但上浮時間增加。恢復至最適pH后，濾紙片上浮數(shù)量增加，上浮時間縮短。但這些組的酶促反應速率均低于 C 組，說明 H2O2酶在pH6.0時活性最強，在pH 為2.0條件下完全失活，但在pH 為10.0條件下相對耐受，恢復至合適pH 以后，其活性可以部分恢復，此結論與葛暄等的實驗一致。

天然態(tài)酶分子（N）會經(jīng)過一系列相對穩(wěn)定的中間態(tài) U1、U2等，最終過渡到變性狀態(tài)，中間狀態(tài)時仍具部分活性，而且是可逆過程，只要除去不利因素，酶活性就可以恢復到原有狀態(tài)。本實驗中，當酶處于pH 為10.0的堿溶液中時，酶的空間結構發(fā)生一定程度的改變，只具有部分酶活性，但是此時仍處于相對穩(wěn)定的中間態(tài)，沒有達到變性態(tài)。因此將酶從 pH 為10.0的溶液中轉(zhuǎn)移至pH為6.0的溶液后，酶活性有一定程度的恢復，酶促反應速度加快。而 A、B 組的酶置于 pH 為2.0的緩沖液后，酶分子越過中間態(tài)，直接到達變性態(tài)，完全失活，即使重新置于最適pH 中，酶活性也不能恢復。

3 實驗反思

3.1優(yōu)化濾紙片處理，拍攝視頻回看計時

濾紙片上浮法相比排水集氣法操作更簡單，現(xiàn)象更直觀。但由于濾紙片上浮速度較快，計時可能出現(xiàn)誤差；不同組別先后處理產(chǎn)生的時間差也可能使土豆片久置，導致初始酶活性產(chǎn)生變化。因此可將所有濾紙片分別處理后分組晾掛在試管外壁上，實驗開始時，將所有晾有濾紙片的試管同時浸入 H2O2溶液中，利用相機拍攝濾紙片從杯底上浮至液面的全過程，實驗結束后回看視頻對各組進行分別計時（圖3）。視頻計時保證了計時的準確性和初始酶活性的一致性，也為教師的課堂教學提供了寶貴的實錄素材。

3.2合理確定固定化時間

固定化時間對酶活性的作用具有兩重性。延長固定化時間能增加H2O2酶的固定效果，使酶更充分的吸附在濾紙片上。然而，固定化時間過長，土豆勻漿中 H2O2酶被微生物分解，活性則會大大降低。因此，控制合理的固定化時間對于提高酶的吸附效率具有重要意義。土豆中的多酚氧化酶會引起多酚類物質(zhì)的逐漸氧化，使勻漿出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，隨固定時間的延長，褐色逐漸加深。因此在實際操作中，可根據(jù)土豆勻漿的顏色來確定何時終止固定過程。當土豆勻漿顏色變?yōu)闇\紅棕色時，固定化效果最好。

3.3自主學習合作探究

實驗過程中，教師引導學生圍繞學習目標展開由淺入深，由表及里的探究活動，實現(xiàn)自主學習和合作探究的高度統(tǒng)一。預習時學生提問：為何將濾紙片浸泡在酶液中？教師可引導學生查閱選修中的固定化技術及相關資料對固定化方法進行自主預習；實驗后學生提問：過酸過堿條件下酶活性是否可逆？教師可引導學生自行設計實驗方案，合作開展探究，同時鼓勵學生自學Excel等軟件，小組互助對實驗數(shù)據(jù)展開分析和解讀。由于課堂時間限制，學生只測量了 H2O2濃度為1%、2%和3%時的酶促反應速度，具體的飽和底物濃度可由興趣小組在課后進行深入探索。總之，學生在課堂上出現(xiàn)的任何問題都可以成為課堂生成的資源，真正體現(xiàn)了以學定教，動態(tài)生成的教學理念。

參考文獻：

[1]王桔紅，謝莉，萬紫微，魏梓欣.“比較過氧化氫在不同條件下的分解”實驗材料探索與改進[J].中學生物教學，2019（24）：62-63.

[2]徐彤.濾紙圓片在提升學生 STEM 素養(yǎng)中的應用——以“不同pH對酶活性的影響”實驗設計教學為例[J].中學生物教學，2019（17）：35-38.

[3]陳加敏.酶濃度和底物濃度對酶活性影響因素的教學探討[J].生物學教學，2020，45（09）：78-80.

[4]葛暄，徐海麗.探究pH對過氧化氫酶活性恢復的影響[J].安徽教育科研，2019（06）：98-100.