動物實驗替代技術在化妝品研究與評價中的應用與挑戰

岳蕓蕓 尚靖

關鍵詞：替代技術；化妝品；毒理學檢驗；功效評價

隨著全球生命科學和信息技術的高速發展，動物實驗替代技術作為實驗動物學和毒理學學科的重要分支得到了快速發展，其應用涵蓋了生物醫藥、化工和環境科學等多個領域。從1959 年“3R”原則提出，60 年來，全球動物實驗替代技術的發展經歷了起步和累積階段（1959 ～ 1990 年）和法規接受階段（1991 ～ 2012 年），目前已進入快速發展階段（2013 ～ 2023 年）。自2013 年起，歐盟宣布全面禁止對化妝品成分進行動物測試，并禁止銷售經動物測試的化妝品和化妝品原料，截至目前，全球已經有30 多個國家和地區實施了關于化妝品動物實驗的禁令。受國際實驗動物福利及“3R”原則的影響，我國科技部于1997 年在“九五”和“十五”計劃期間將實驗動物替代研究列入實驗動物基礎性研究的重點內容，明確指出動物實驗應遵循“3R”原則。并且自2014 年起，首次免除國產非特殊用途化妝品的強制性動物實驗要求，近20 多年來我國有序穩步地推進化妝品替代實驗的發展。目前，相關技術主要用于毒理學檢測和安全評估方面。本文對國內外動物實驗替代的發展歷程與新替代技術進行了綜述，為我國化妝品的國際化發展提供借鑒。

20 世紀初，全球范圍內多起嚴重的藥品安全事故推動了動物實驗在新藥開發過程中應用于毒理和安全性測試。1938 年，FDA 頒布的《聯邦食品藥品及化妝品法案》要求化妝品提供確保安全性的證明，實施“動物試驗強制令”。毫無疑問，動物試驗為人類健康作出了重要貢獻。從概念及內涵上看，動物實驗是以實驗動物為材料，采用各種方法在實驗動物身上進行的科學實驗研究，但實驗周期長、花費大，且由于種屬差異等使實驗結果在預測人體毒性風險時存在著不確定性[1-3]。

1959 年，英國學者Russell和Burch 最早在著名出版物《Theprinciples of humane experimentaltechnique 》（《人道主義實驗技術原理》） 中系統提出“3R” 原則，即通過使用無知覺的材料代替（replace）有意識的活體高等動物，在確保獲取一定數量和精度的信息前提下盡量減少（reduction） 動物使用量，采取優化措施（refinement） 減輕動物痛苦的發生和嚴重程度[4]。1978年，David Smith 在《Alternatives toanimal experimentation 》一書中將“3R”統稱為“替代”（Alternatives）。“3R” 不僅是替代方法的發展方向，也是替代方法的代名詞，更是動物實驗替代方法的核心和主要研究內容。替代試驗與“3R” 原則反映了實驗動物科學由技術上的嚴格要求轉向人道主義管理，在保證實驗科學性的前提下盡可能地減少實驗動物的使用、減輕或消除動物痛苦，提倡實驗動物福利與動物保護[2]。20 世紀下半葉，全球各地替代方法研究和驗證機構的成立推動了全球替代方法的推廣和應用[4-6]。至20 世紀80 年代，動物保護組織反對化妝品的動物測試，以歐盟為首的多個國家和地區實施化妝品動物實驗禁令；到2022 年9 月，美國參議院通過FDA 現代化法案《FDA Modernization Act 2.0 》，其中提到終止“動物實驗強制令”，標志著動物實驗在全球多個國家和地區由“強制執行” 轉為“強制禁止”。

化妝品的安全性和功效性評價在保障化妝品質量和消費者使用安全方面具有重要意義，尤其是隨著國際動物福利和“3R” 理念的發展與科學技術的進步，越來越多的替代新方法、新工具被應用到化妝品評價中。在藥物研發領域，FDA 于2022 年9 月提出新的指導方針，要求減少動物試驗并盡量利用動物實驗替代技術取代動物試驗。化妝品領域，目前世界范圍禁止動物實驗主要有兩種模式：一是歐盟、印度等采用的一刀切形式，全面禁止各種動物實驗；二是依據科學的發展規律，切實考慮到安全性評價的實際需要，只禁止部分存在其他優選方法的動物實驗，分階段試行，其中我國和日本等國家采用后者。

全球化妝品動物替代的發展歷程

世界動物保護組織很早就提出疑問，化妝品僅僅是為了人類自己的美麗，而要給動物帶來痛苦和死亡，這不符合人道主義，這也是目前國際上反對進行化妝品動物實驗的主要理由。而這種動物保護主義的呼聲客觀地推動了動物替代方法在化妝品毒性實驗中的研究和開展。“3R” 理論的提出，影響著世界各國有關實驗動物法規的研究和制定，并激勵著科學家和研究機構投入替代技術開發[7]。

1969 年，英國成立了醫學試驗用動物中替代法基金會（FRAME），成為全球最早的替代方法研究機構，此后世界各國相繼成立替代方法研究和驗證中心，開展替代方法的研究、驗證、標準化和推廣應用。1994 年，世界經濟合作和發展組織（OECD） 開始編制替代方法的驗證指南。這些替代方法驗證機構的成立，使得大量研發投入產生的新技術、新方法和新產品有了被法規認可的渠道，推動了替代技術的進步。其中，經替代方法驗證中心認可的試驗方法可以申請納入OECD、人用藥物注冊技術要求國際協調會（ICH）、國際化妝品監管合作組織（ICCR） 或其他國家地區的法規標準。2013 年3 月11 日起，歐盟完成了化妝品及成分的動物試驗禁令和銷售禁令的實施，給全球法規和替代方法的研究帶來深遠的影響[8-9]。2008 年，ICCR 成立替代試驗方法國際合作組織（ICATM） 相關工作組，以加強技術交流與合作，并逐步對已有替代方法組織討論，并列出認為可用于化妝品的方法，涉及皮膚刺激性/ 腐蝕性、光毒性、眼刺激性/ 腐蝕性、急性毒性、內分泌干擾物、基因毒性等，多為OECD 發布方法。隨后幾年，逐步對列舉方法做出更新[10]。

我國科技部最早于1997 年在“九五” 和“十五” 計劃期間將動物實驗替代研究列入實驗動物基礎性研究的重點內容，明確指出動物實驗應遵循“3R” 原則，并于2006 年發布了《關于善待實驗動物的指導性意見》。2011年，國家藥品監督管理局啟動《化妝品動物實驗替代方法體系研究》項目；2018 年，中檢院成立全國化妝品替代方法研究與驗證工作組。但截至目前，我國尚無“3R” 立法及國家層面的替代中心來主導替代方法的研究和驗證工作。到2016 年，首個替代方法被納入《化妝品安全技術規范》，標志著我國正跟隨國際化妝品替代的步伐，穩步推進化妝品產業的國際化水平（見圖1）[11，12]。

我國化妝品動物實驗替代方法的現狀

隨著科學技術的進步和化妝品動物禁令的不斷推廣 ，動物替代試驗的發展和應用成為化妝品評價中的重要課題。我國在動物替代試驗技術研究和方法推行方面起步較晚，但在化妝品動物替代試驗方法標準認可方面緊隨國際標準的發展趨勢。2016 年，《化妝品用化學原料體外3T3 中性紅攝取光毒性試驗方法》是首個被納入《化妝品安全技術規范（2015 年版）》（以下簡稱“《規范》”） 的替代方法。截至目前，我國已有近10 項替代方法被列入《規范》，此外還在同步針對多項OECD 驗證的方法進行研究、驗證和轉化。但目前我國化妝品行業發展和產品注冊備案對動物實驗替代方法仍然需求迫切，化妝品替代標準不足和必需的細胞、模型或試劑等存在國際技術壟斷的現狀，因此，重點研發具有自主知識產權、助力產業、服務注冊備案的靶標細胞系、3D 組織、器官芯片、低等模式生物等模型及技術是我國化妝品行業未來替代方法發展重點關注的方向（見表1）[13，14]。

下一代替代理念與技術的興起

隨著生命科學技術的快速發展，全球替代方法進入快速發展階段，在21 世紀毒性測試新觀念（TT21C）、整合測試評估策略（IATA）、有害結局通路（AOP）、下一代風險評估（NGRA）等理論的指導下出現一系列的新技術、新方法， 如靶標細胞模型、器官芯片、低等模式生物、計算毒理學等高通量的動物實驗替代新技術。傳統的替代技術，主要體現為動物實驗系統向體外實驗系統轉換而建立的方法，如體外細胞培養、離體器官等。在現代替代方法中，則體現在充分理解生物學過程及在分子機制的基礎上結合現代生物科學技術及信息技術，如非生物測試技術（如定量構效關系、交叉參照、分類法、毒理學閾值、計算毒理學等）、基因編輯技術、組學技術（基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組、脂質組）、基于微生理的組織工程技術、干細胞技術、圖像識別技術、計算機模擬技術等，使替代方法更多元化，也更符合人整體的生理病理過程[15-18]。

1. 整合測試評估方法與有害結局路徑評價技術

由于單一替代方法存在局限性和適用性問題，因此在毒理學全面評估中可參考OECD 發布的整合測試與評估方法（IATA） 指南，進而合理地、科學地采用單一方法的組合模式。評估過程不僅可以考慮現有的測試方法，還加入計算機預測方法、化學結構特征信息、人群暴露等。此外，對于復雜的毒性終點的風險評估，也可以采用IATA，以避免單一替代方法無法完整覆蓋有害結局路徑（AOP） 全過程的局限。如OECD 于2016 年通過皮膚致敏AOP 框架，皮膚致敏的 AOP 事件總共包含 4 個“關鍵事件”：關鍵事件 1（KE1） 分子啟動事件是親電物質與皮膚中的親核中心共價結合，為分子層面的表達（替代方法為DPRA，ADRA）；KE2 事件是角質細胞的活化，為細胞水平的表達（替代方法為KeratinoSensTM，Lusens）；KE3 是樹突狀細胞的活化，為細胞水平的表達（替代方法為h-CLAT，U-SENS，IL-8-Luc）；KE4 是 T 細胞活化和增殖，為組織器官層面的表達檢測（替代方法為LLDA）[19，20]。

2. 基于干細胞的評價技術

干細胞具有無限增殖及分化潛能，利用人胚胎干細胞（ESCs） 或誘導的多能干細胞（iPSCs） 技術，為替代方法的研究提供了穩定的人源化干細胞衍生細胞的來源，有望在一定程度上解決物種間外推的需要。例如，利用iPSCs 定向誘導分化腎近端小管上皮細胞，可用于評價靶器官毒性的替代方法開發；利用iPSCs 定向誘導分化角質形成細胞、成纖維細胞等多種皮膚組織的細胞類型，可用于構建體現皮膚結構與功能特征的人源化的表皮、全皮和功能性皮膚類器官模型。但多能干細胞誘導形成各類組織細胞類型的一致性、穩定性和功能性是干細胞技術應用于替代方法開發中需要解決的關鍵問題[5，21]。

3. 基于組學分析的評價技術

近年來，基于人體遺傳物質信息傳遞及機體代謝流程的多組學技術，包括基因組學（遺傳信息）、轉錄組學（基因轉錄的信使RNA）、蛋白質組學（基因表達產物蛋白質）、代謝組學（代謝產物）、脂質組學（脂質類代謝產物）、微生物組學（與人體共生的微生物，如細菌、真菌等） 在內的組學技術得到了快速發展。

人們逐漸從過去關注某一個基因、蛋白或代謝產物的變化轉向關注整體調控網絡的變化，這使研究者們從更為宏觀的角度去發現生物體生理代謝的整體微觀變化，有助于推動建立更有效的安全性評估策略和毒性預測技術[5，15]。

4. 基于組織工程的評價技術

器官芯片是由微流控設備與活細胞結合而成的微型結構，可在體外重現體內器官的生理和病理特征。盡管ICCR 將器官芯片技術應用于化妝品原料風險評估中被認為是目前尚不足以成熟運用的方法。但2022 年8 月，FDA批準了全球首個完全基于“類器官芯片” 研究獲得臨床前數據的新藥進入臨床試驗（NCT04658472），成為行業里程碑事件。模擬皮膚結構的3D 皮膚模型是組織工程技術在皮膚方面的成功應用實例。

由于進口3D 皮膚模型的儲存、運輸以及使用的時效性問題，OECD 中的替代方法TG 431、439、498，利用3D 皮膚器官芯片進行化妝品原料或成品的皮膚腐蝕性、刺激性、光毒性等安全性測試，目前在我國尚未推廣應用。因此，構建自主知識產權3D 組織器官模型，建立皮膚芯片、多器官級聯系統，如結合微流控技術構建3D肝—皮膚、腎—皮膚雙器官芯片模型，通過理化試驗方法、分子生物學方法、病理染色及診斷技術對模型進行表征和驗證是我國組織工程技術應用于化妝品替代方法開發的關鍵方向。

此外，器官芯片中所使用細胞的來源及異質性問題，限制了器官芯片的產業化、規模化及檢測穩定性；而缺少系統性環境，如血管、神經、屏障功能等也限制了其適用范圍。因此，未來器官芯片領域是否提供即用型穩定的微流體設備，能否提供完全可操作、適用性強的器官芯片，能否提供從初始設計到售后的全方位服務解決方案是行業發展的方向[15，22]。

5. 基于低等脊椎動物的系統評價技術

近年來，以斑馬魚為代表的低等脊椎動物，由于實驗材料豐富、成本低、研究時間短、直觀性好等優勢，成為替代模型候選生物材料。目前，斑馬魚已被廣泛用于環境毒性檢測、藥物早期高通量篩選等毒性測試中。針對斑馬魚在生態環境檢測中的應用，OECD 專門制定了一系列基于斑馬魚的毒性測試操作指南。根據歐盟動物保護法規定，5 天以內的斑馬魚胚胎和幼魚由于自帶卵黃囊，無須進食，因此不受動物保護法限制，被國際科學家大力推薦用于替代哺乳動物測試，符合“3R” 原則。

多項研究表明斑馬魚皮膚結構、功能以及生物信號傳導通路都與人類皮膚具有一定相似性。而國際上早在20 世紀90 年代就開始應用斑馬魚作為實驗模型進行色素調節成分的篩選和評價、抗紫外線成分的篩選和評價、防曬劑、染發劑、激素以及納米材料的體內毒理學評價、皮膚傷口炎癥反應與愈合機理、皮膚色素沉著機理及修護方法等方面的皮膚科學研究以及化妝品開發研究。此外，針對我國的原料，有近三分之一是組分和濃度不確定的動植物提取物，斑馬魚作為整體模型具備細胞和離體組織器官不具備的多維評價潛能。但值得注意的是，由于斑馬魚缺乏皮膚角質層、毛囊、皮脂腺等皮膚結構，且我國實驗用魚尚缺少標準化的質量控制標準，因此，開展模式動物斑馬魚應用于化妝品安全及功效評價的適用性研究、質量標準以及試驗管理規范對于推進斑馬魚應用于化妝品研究與評價具有重要意義。

總結與展望

動物實驗替代技術是未來發展的趨勢。皮膚組織是一個復雜的系統調控器官。作為化妝品安全及功效評價的替代模型，首先要關注模型與人體皮膚組織生理反應的相關性，使用時需要考慮方法的局限性和適用條件[23]。替代方法的結果應當與預期回答的毒性或功效終點之間建立預測關系，如何建立與人類皮膚生理反應更相關、重復性好、評價可信度高且可標準化、易推廣的替代模型，是未來動物實驗替代技術在全球化妝品行業推廣應用的關鍵技術問題。但同時我們應該認識到，動物是一個完整的生物系統，這是任何一個替代方法所不具備的優點。只有這樣，才能避免夸大替代方法的作用，給替代方法一個正確的、客觀的評價。

總的來看，我國化妝品動物實驗替代方法研究起步較晚，與歐美等發達國家和地區還存在一定差距。我們需要加強對人體皮膚生理反應、分子機制的充分理解認識，并在此基礎上加強替代方法的研究與驗證工作，開發精準的、科學的、可驗證、可重復推廣的動物實驗替代方法，推動我國化妝品行業與全球技術接軌，這也是保證我國經濟發展和社會進步的需要[24，25]。