國際化妝品原料遺傳毒性評估的關注點

文海若 柴學麗 吳輝 耿興超

化妝品原料進行遺傳毒性評價的背景介紹

化妝品是消費者長期日常使用的產品，涉及各個年齡段。因此，安全作為化妝品研發的首要因素，受到研發單位和監管機構的高度重視。《國際化妝品原料標準中文名稱目錄（2010 年版）》中已收錄了超過15000 種化妝品原料。國內《已使用化妝品原料名稱目錄》中收載了近9000 種化妝品原料，目錄以外的化妝品原料視為新原料，經過毒理學評估后方可使用。隨著動物試驗“3R”（reduction， replacement， refinement， 即動物使用的減少、替代和優化） 原則和替代理念的推廣，歐盟國家自2013 年3 月起全面禁止銷售經過動物試驗的化妝品（含化妝品原料）。國際上，鼓勵使用更先進的科學手段進行化妝品的安全性評價，包括以風險評估的方式減少終產品的毒理學檢測，以及發展可靠的毒理學替代方法。

遺傳毒性試驗用于檢測受試物是否存在誘導機體遺傳物質損傷風險，從而預測受試物的致癌性。當遺傳毒性試驗結果為陽性時，提示受試物為潛在的人體致癌劑或致突變劑。腫瘤的發生機制復雜，而單一遺傳毒性評價方法難以涵蓋多種檢測終點。故用于監管的遺傳毒性數據，需來自評價終點互補的體外和體內試驗組合，以從多種角度對受試物的遺傳毒性風險進行評估。《化妝品安全技術規范》列出了6 項遺傳毒性試驗方法，并指出遺傳毒性試驗項目至少包括1 項基因突變試驗和1 項染色體畸變試驗。其中，細菌回復突變試驗（Ames試驗）是首選的遺傳毒性試驗，與體外哺乳動物細胞試驗相結合，可檢出絕大多數導致嚙齒類動物腫瘤的物質，其檢測的靈敏性達74.3%[2]。

傳統遺傳毒性試驗方法評價化妝品原料時存在的問題

化妝品是由天然、合成或提取物質作為原料經調配加工而成的復配混合物，如油性原料、粉質原料等。化妝品原料的性質和有色成分可能對Ames 試驗或體外染色體畸變試驗體系產生干擾。如化妝品成分中含有組氨酸或色氨酸成分，則可能在Ames 試驗中得到假陽性結果。一些在體外哺乳動物微核試驗和染色體畸變試驗中檢測結果為陽性化學物質（如芳香胺類），在相同檢測終點的體內研究中并不具有遺傳毒性或致癌性[3]，其原因與體外試驗系統缺乏體內代謝補償機制有關。再如，微核試驗結果易于受到pH 值和滲透壓的影響。此外，具有氧化作用機制的化合物在體外評價體系中易于得到假陽性結果。而過高的細胞毒性是導致體外細胞致裂性試驗假陽性結果的另一主要因素[4]。此外，化妝品多以局部皮膚外用為主，體內吸收和全身分布較少。如有潛在毒性風險的對苯二胺人體經皮吸收率僅為0.18%[5]，體外試驗中通常選擇較高濃度受試物與細胞作用，試驗結果與人體毒性外推存在較高不確定性。傳統遺傳毒性評價方法在應用于化妝品原料藥的評價時需進行一定優化。歐盟化妝品指令第7 次修訂（2003/15/EC） 已于2009 年3 月開始禁止對化妝品成分進行體內遺傳毒性試驗。化妝品公司考慮到排除體外試驗陽性結果所需的時間和資源成本，往往會摒棄體外試驗中得到陽性結果的化學品原料。目前的體外遺傳毒性試驗研究重點在于如何提高試驗結果的準確性，并找到更加合適且有效的體外替代模型進行遺傳毒性評價[6]。

歐洲化妝品、盥洗用品和香水協會（EuropeanCosmetic .Toiletr y and Per fumer y A s sociation，COLIPA） 于2004 年成立了遺傳毒性研究小組，一方面對現有體外標準遺傳毒性試驗方法進行改良，從而減少假陽性結果；另一方面推進新評價方法作為標準組合試驗結果為陽性的化合物的后續選擇。研究發現，假陽性結果主要來自II 相代謝酶活力不足的細胞系和p53 功能缺陷的細胞系，前者的解毒能力不足，后者DNA 修復功能較差。來自人源細胞（如人淋巴細胞、TK6 細胞和HepG2 細胞）的結果與傳統的CHL、CHO 或V79 相比，特異性更佳[7]。此外，細胞毒性過大可導致假陽性結果，試驗時需進行細胞毒性相關指標檢測，以支持試驗濃度設置的合理性。

近年來，隨著替代毒理學的興起和組織工程技術的應用，三維（3 dimensions， 3D） 重組人工皮膚模型在化妝品毒性替代模型的研發中嶄露頭角。3D 重組皮膚模型使用人來源的皮膚組織構建，試驗周期較短，試驗結果與人體毒性結果相比更具可比性和針對性。盡管目前研發的人體皮膚模型尚不包含毛囊、皮脂腺、神經、循環和淋巴系統，研究數據與人體臨床試驗數據的相關性還有待商榷，但極有可能在今后列入安全性評價指導原則或相關標準，在監管領域有重要前景。以下就人3D 重組皮膚模型在遺傳毒性評價中的研究進展與應用前景進行闡釋。

3D 重組皮膚模型在化妝品原料遺傳毒性評價中的應用

皮膚是人類最大的器官，由多種類型的細胞共同構成阻擋有害物質進入機體的第一道天然屏障。首個體外表皮模型于20 世紀70 年代成功構建，其初衷是解決臨床患者大面積皮膚損傷與缺失修復的瓶頸，之后逐漸應用于體外化妝品安全性評價[8]。3D 重組皮膚模型將人皮膚細胞培養于特殊的插入式培養皿后得到，具有完整的3D 皮膚解剖結構，從功能和結構上模擬人體皮膚，在化妝品毒性評價中具有重要價值。因此，難溶的、膏狀和油脂類配方的受試物以涂抹的方式放到皮膚模型上，解決了體外試驗中化妝品制劑性質特殊的問題。此外，3D 皮膚模型可以提供毒代動力學數據為毒理學數據分析提供支持。然而，因當前模型不包含毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬結構，且屏障功能低于真實皮膚，3D 模型試驗中的經皮吸收率通常高于真實人群使用情況[9]。今后應著重研發與人體接近的、適合不同類產品評價需求的、穩定的、可長期重復給藥的皮膚模型。

目前已應用于遺傳毒性試驗研究的商品化皮膚模型包括美國MatTek 的EpiDermTM 和Epi-200 和法國歐萊雅的EpiSkinTM。其中表皮模型主要用于微核試驗，而全皮模型則更適用于靈敏度較高的彗星試驗。

1. 微核試驗

COLIPA 組織歐盟、美國及日本多家實驗室開展基于EpiDermTM 的國際實驗室間聯合驗證，通過試驗方法標準化、已知毒性受試物小范圍驗證和大量受試物實驗室間聯合驗證逐步確認試驗方法及其復現性[10]。當前已完成29 個受試物的大規模驗證結果發現EpiDermTM 的特異性達到88.1%，靈敏性達62.5%， 而一致性達到81%。比較EpiDermTM 和正常人表皮角化細胞對多種已知體內非遺傳毒性及遺傳毒性化合物的試驗結果，發現受試物不經S9作用即可得到接近體內的研究結果，與此同時EpiDermTM也可較好地排除因毒性引起的體外培養細胞假陽性結果[11]。Hu et al 也使用EpiDermTM 對7 種化合物開展驗證并指出該模型可實現接近體內研究的暴露條件，有效對染色體損傷風險作出預測[12]。近年來，EpiSkinTM 皮膚模型也陸續開展微核試驗的驗證工作，一項就17 種化合物的胞質分裂阻斷法微核試驗研究發現其用于評估化合物遺傳毒性的特異性、準確性及一致性分別達到60～75%、83～85% 和76～82%，且72 小時長時間暴露于受試物的方式可有效提高遺傳毒性物質的檢出率[13]。中國EpiSkinTM皮膚模型微核試驗方法已于我國完成初步驗證，結果顯示該模型的穩定性和細胞增殖活力可滿足試驗需求，并可確將陽性物質長春新堿、N- 乙基-N- 亞硝基脲、3-丁內酯、2-乙酰氨基芴和陰性物質環己酮、2，4- 二氯苯酚的遺傳毒性進行歸類，證明其具備一定預測能力，在今后將進一步驗證并推廣。MatTek 的Epi-200 皮膚模型也完成了歷時7 年的微核試驗聯合驗證[14]。美國和歐洲的4 個實驗室對43個化合物的驗證結果顯示，與體內遺傳毒性結果相比，該模型總體準確率為 80%，靈敏度為 75%，特異性為 84%；實驗室間和實驗室內的重現性分別為 77% 和 84%。 此外，72h 暴露方案比48h 更為靈敏。當前使用三D 皮膚模型微核試驗數據作為化妝品安全性監管的資料已提交至歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validationof Alternative Methods， ECVAM）。

2. 彗星試驗

彗星試驗主要用于預測受試物的DNA 反應性，可與體外微核試驗形成互補。COLIPA 已分階段使用EpiDermTM 開展體外彗星試驗實驗室間聯合驗證工作。在第一階段和第二驗證的工作中分別使用甲磺酸甲酯、4-硝基喹啉、乙酰基亞硝基脲、2，4- 二氨基甲苯、硝基苯酚、環己酮等對模型進行驗證，發現該模型的復現性較好。然而溶劑組背景值過高（高于30%） 成為進一步大規模驗證的瓶頸。也有研究提示使用尚未發育完全的細胞模型EPI-201 可減少運輸時長對皮膚模型質量的影響，從而降低背景值[15]。化妝品歐洲遺傳毒性專項組（CosmeticsEurope Genotoxicity Task Force） 和德國聯邦教育與研究部使用全皮模型如EpiDerm FT 或Phenion? FT研究使用其開展彗星試驗的重復性和預測效力[16]。在Reisinger 等[16] 進行的驗證研究中，使用絲裂霉素C、氯化鎘、N- 乙基-N- 硝基脲、7，12- 二甲基苯并蒽、沒食子酸丙酯、丁香酚、鄰苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯、環己酮等8 種化學品在Phenion? 全層皮膚模型上進行驗證，3D 皮膚彗星測定法顯示出較高的預測能力以及良好的實驗室內和實驗室間可重復性。

Flamand et al，使用EpiSkinTM 研究洛美沙星的光遺傳毒性，即模型涂抹洛美沙星并經紫外照射后再取皮膚組織開展彗星試驗，驗證只有洛美沙星涂抹與紫外照射同時存在時組織細胞的尾DNA 百分率顯著性升高，提示其存在光遺傳毒性。該結果與人體皮膚試驗結果一致[17]，提示模型具有較好的代謝功能。我國研發的人源重建皮膚模型EpiKutis 也已使用鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8- 甲氧基補骨脂和十二烷基硫酸鈉建立了國產人源重建皮膚模型的體外光毒性試驗方法[18]，為皮膚光毒性替代檢測方法提供了新補充。

化妝品遺傳毒性評價的決策思路

COLIPA 基于上述研究結果，提出以下化妝品遺傳毒性評價的決策思路[6]。首先應根據已有的數據和資料，包括理化屬性、暴露和代謝方式、遺傳毒性及致癌性數據對化妝品原料的風險進行預判。在此基礎上進行證據權重分析（weight of evidence，WoE），判斷是否有足夠數據支持化合物具有或不具有遺傳毒性風險。如果當前數據足夠作出判斷，則進行風險評估分析，認為化合物具有遺傳毒性或人體暴露后的致癌性風險極低，無需后續試驗。如果當前數據不足以作出判斷，則開展Ames 試驗、體外微核試驗/ 染色體畸變試驗或哺乳動物細胞基因突變試驗。體外試驗結果均為陰性時，再次使用證據權重法進行分析并得到結論。如體外試驗結果為陽性，需判斷所選擇的試驗方法是否適宜及是否充分。

體外試驗結果為陽性的第一種可能即Ames 試驗結果為陽性，而體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結果為陰性。此時，需進行哺乳動物基因突變試驗。如hprt 基因突變試驗為陰性，再結合Ames 試驗陽性結果與哺乳動物試驗體系的不相關性分析，可排除Ames 試驗陽性結果帶來的遺傳毒性風險擔憂。另一個方案是開展敘利亞倉鼠胚胎（Syrian hamster embryo，SHE） 細胞轉化試驗。該方法通過檢測原代SHE 細胞形態變化，評價化合物的致癌性風險，試驗結果與嚙齒動物致癌性評價數據的一致性達到近80%[19]。含芳香胺化合物的染發劑通常在Ames 試驗中得到陽性結果，但SHE 試驗可以對存在致癌性的芳香胺和非致癌性的芳香胺進行準確的區分（結果準確率達到90%）[20]。它也可以對遺傳毒性致癌性化合物（直接作用于機體遺傳物質的致癌物） 和非遺傳毒性致癌性化合物（不直接作用于機體遺傳物質的致癌物） 進行區分。值得注意的是，因該方法涉及放射線的使用，其推廣和普及受到了限制。此外，基于3D 皮膚模型的彗星試驗也可以作為第三種選擇。彗星試驗有助于檢測到廣譜的DNA 損傷（包括基因突變和染色體損傷）。此外，可考慮Ames 試驗結果為陽性是否與閾值有關。基于機體的保護性DNA修復機制，人體通常可容忍低水平DNA 損傷，如果實際暴露量低于某一閾值則致癌性風險可忽略。如研究發現烷化劑甲磺酸乙酯在體外和體內均存在作用閾值[21]。進行閾值分析時需結合暴露水平與閾值濃度進行評估。

體外試驗結果為陽性的第二種可能即Ames 試驗結果為陰性，而體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結果為陽性。后續試驗的首選方法是開展基于3D 皮膚模型的微核試驗或彗星試驗，然而該試驗尚不能成為一個獨立的系統，但作為常規體外微核和彗星試驗的后續試驗有助于證據權重評估[6]。此外，SHE 細胞轉化試驗和閾值分析也可作為備選后續評估方法。

體外試驗結果為陽性的第三種可能即Ames 試驗結果和體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結果均為陽性。則需要根據前兩種可能的后續試驗選擇考慮開展適當的試驗進行驗證[6]。

小結與展望

化妝品原料的遺傳毒性風險應根據其本身的性質、結構和功能類似物的信息、代謝物等的現有數據或預測結果，以證據權重的方式做出評估。基于3D 皮膚模型的微核試驗和彗星試驗為骨髓和外周血暴露量較低的化合物的遺傳毒性評價，提供了有價值的評價方法。對于局部涂抹類藥物而言，如在標準遺傳毒性試驗組合中體外微核/ 染色體畸變試驗中獲得陽性結果，可考慮以3D 皮膚微核/ 彗星試驗作為后續試驗選擇。應用3D 皮膚模型開展體外微核試驗和彗星試驗獲得的數據與2D 培養條件下獲得的結果相比，假陽性率更低，準確性更高。而基于3D 皮膚模型的彗星試驗作為微核試驗的重要補充，后續需對試驗條件進行進一步優化。在體外替代評價方法大行其道的趨勢下，如何優化體外遺傳毒性評價試驗條件及策略、驗證3D 模型的代謝能力和確證該模型的可靠性，成為現階段需著力攻克的重點。