體外和體內研究表明松茸提取物可降低色素沉著

王一鳴 安全 楊楊 霍彤 邵雪 權強華

關鍵詞：松茸；色素沉著；酪氨酸酶活性；轉錄組測序

在人類皮膚中，黑色素在表皮底層的黑色素細胞中合成，是抵御紫外線引起的皮膚損傷的重要保護元件[1， 2]。雖然黑色素能夠吸收紫外線，刺激皮膚生長來保護暴露在陽光下的皮膚，但黑色素過量聚集則會導致皮膚產生色斑、色素過度沉著等皮膚問題。酪氨酸酶以及酪氨酸酶相關蛋白1（TRP-1） 和酪氨酸酶相關蛋白質2（TRP-2） 作為參與黑色素生物合成的主要酶，其酶活性與黑色素生成密切相關[3， 4]。在皮膚色素沉著相關的抑制劑研究中，是否能夠調控酪氨酸酶活性是研究黑色素生成過程的重要方向[5，6]。目前熊果苷、曲酸和維生素衍生物多被用作改善皮膚色素沉著的成分。然而，由于安全性問題，如嗜鉻癥、萎縮癌變和其他局部或全身的副作用，使得天然藥用植物資源代替皮膚色素沉著抑制劑成為護膚品研究關注的重點領域[7-10]。

松茸（Tricholoma matsutake，TM） 是一種外生菌根共生真菌，屬于松茸亞屬，也是一種非常重要的食用菌，營養豐富，味道鮮美。之前研究表明松茸多糖具有多種免疫刺激活性[11]、抗腫瘤活性[12]、抗氧化活性[13]、造血活性和抗突變活性[14，15]。在中國和日本等亞洲國家，松茸被用于疾病的預防和治療已有1000 多年歷史[15-21]。然而，目前還沒有關于松茸在改善色素沉著過度方面的全面性功能性研究。

因此，本研究探討了松茸提取物對B16-F10 黑色素瘤細胞的黑色素合成、酪氨酸酶活性的影響。通過建立動物皮膚色素沉著模型，進一步研究松茸對膚色調節的作用。隨后，為了確定松茸提取物對人類皮膚色素沉著的影響，檢測了34 名受試者在使用了松茸提取物后皮膚顏色和光澤改善情況。最后為了探索松茸提取物潛在的抗色素沉著機制，對UVB 刺激和松茸提取物處理后的B16-F10 細胞進行了轉錄組測序分析。

01實驗部分

1.1 主要試劑

含有10%（v/v） 胎牛血清（FBS） 和1% 鏈霉素—青霉素的細胞培養基（DMEM） 購自GIBCO Invitrogen。磷酸鹽緩沖溶液購自康寧公司。蘑菇酪氨酸酶和l-3，4- 二羥基苯丙氨酸（L-DOPA） 購自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密蘇里州，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備松茸提取物

松茸在100℃去離子水中提取，隨后用H1O3 大孔吸附樹脂和40% 乙醇純化。

1.2.2 細胞培養

小鼠黑色素瘤B16-F10 細胞在DMEM 培養基中進行培養，并在37℃的5%CO2 培養箱中保存。

1.2.3 細胞活力測定

利用CCK-8 測定法測量松茸提取物誘導后的B16-F10 細胞增殖水平。首先將細胞接種于DMEM 的96孔板中并培養24 h。隨后將松茸提取物加入細胞中培養24 h，將10 μL 的CCK-8 溶液添加到每個孔中孵育1 小時并測量細胞在490 nm 處的細胞活力。

1.2.4 動物實驗

實驗方案經遼寧中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（SCXK Liao 2015-0001）。C57BL/6 雄性小鼠購自遼寧昌盛生物科技有限公司。飼養條件：溫度20 ～ 24℃；相對濕度55% ～ 65%；晝夜12 h-12 h；可自由進食飲水。小鼠每天暴露于330 mJ/cm2 的UVB 輻射，持續15 天。實驗前將小鼠背部區域電剪刀剃毛（面積均為2 cm×2cm），隨后用0.2%、0.5%、1% 的松茸提取物和3% 的熊果苷對小鼠背部皮膚進行局部給藥，每天兩次，持續40 天。

1.2.5 B16-F10 的黑色素含量和酪氨酸酶活性測定

B16-F10 細胞在37 ℃ 和5%CO2 的培養箱中培養24h。在加入50 μM 的8-MOP（8- 甲氧補骨脂素） 之前，用松茸提取物預處理細胞6h。24h 后丟棄上清液，并用1 mL PBS 洗滌兩次。使用1 mL 1 moL/L NaOH（含有10%DMSO） 溶解B16-F10 細胞中的黑色素，測定490nm 處吸光度。

1.2.6 小鼠皮膚的黑色素含量測定

在松茸提取物和熊果苷處理后的40 天，使用多功能皮膚UV 分析儀（ES-3100） 檢測小鼠背部皮膚的黑色素指數。

1.2.7 小鼠皮膚的酪氨酸酶含量測定

向小鼠腹膜內注射三溴乙醇（240 mg/kg） 進行麻醉，取背部皮膚，并進行精確稱重和勻漿，通過TYRELISA試劑盒測定勻漿中酪氨酸酶的含量。每組3 個重復，取平均值。

1.2.8 志愿者指標采集

研究得到了北京中德聯合化妝品研究所的批準，所有志愿者都充分了解了實驗的目的并簽署了知情同意書。對34 名女性（44 ～ 55 歲） 進行了自身對照研究，評估松茸提取物改善面部皮膚膚色的能力。受試者每晚使用含有松茸提取物的面膜共4 周，測試期間，受試者保持原有的清潔護膚方式、習慣和品牌不變，停用自己的面膜。

1.2.9 人臉皮膚顏色和光澤測定

在22±2℃和50%±5% 濕度環境下檢測皮膚顏色和光澤度。志愿者洗臉30 分鐘后，使用MPA-580（CK，德國） 的Chromeeter CR-400 和Glossymeter GL200 的探頭檢測皮膚顏色和光澤度檢測每個受試者的皮膚狀態。檢測時間分別為試驗前、試驗后2 周和試驗后4 周。

1.2.10 轉錄組分析

本研究對UVB 刺激和松茸提取物處理后的B16-F10細胞進行了高通量轉錄組測序和生物信息學分析，為進一步了解松茸提取物抗紫外機制。以P 值<0.01，|log2FC|>2為標準，篩選8-MOP 處理前后細胞顯著差異表達基因。隨后對上調和下調的顯著差異表達基因進行通路富集分析，包括解析其相關潛在靶點在生物過程（PB）、分子功能（MF） 和細胞成分（CC） 中的作用。

1.2.11 統計分析

使用GraphPad Prism 7.0 版軟件進行統計分析。數據以平均值的平均標準誤差（SEM） 表示，在P 值<0.05 時，數值差異被認為是顯著的。

02結果

2.1 松茸提取物抑制B16-F10 細胞中酪氨酸酶的活性，從而抑制黑色素生成

通過CCK-8 檢測細胞活性以確定松茸提取物的最佳處理濃度。與對照組相比，在較高濃度1 mg/mL 松茸提取物的刺激下未觀察到細胞毒性（見圖2A）。通過測量B16-F10 細胞的黑色素含量發現，以8-MOP 刺激B16-F10 細胞作為黑色素生成模型組，模型組的黑色素含量為對照組的117.54%（p <0.01），高于空白組、加入熊果苷處理的陽性對照組和加入松茸提取物處理組（見圖2B）。如圖2C 所示，松茸提取物以劑量依賴的方式抑制酪氨酸酶活性，與對照組和空白組相比，松茸處理組和陽性對照組的酪氨酸酶活性均顯著下降。

2.2 松茸提取物對動物皮膚具有美白作用

以上結果表明，松茸提取物可以通過抑制B16-F10中的酪氨酸酶活性，從而抑制黑色素的生成。為了確定松茸提取物對小鼠皮膚色素沉著過度的影響，隨后檢測暴露于UVB 后小鼠的黑色素指數變化情況?？瞻捉M小鼠的黑色素指數為3.34，暴露于UVB 15 天后，UVB 處理組的小鼠黑色素指數增至5.04。在熊果苷以及0.2%、0.5%、1%的松茸提取物處理40 天后，黑色素指數分別降至4.585和4.615、3.67、3.04（見圖3A）。并且1% 濃度的松茸提取物對色素沉著過度的修復功效優于熊果苷。

如圖3B 所示，空白組小鼠的酪氨酸酶含量最初為1.28ng/mL，暴露于UVB 15 天后增加到2.54 ng/mL。然而，在熊果苷、0.2%、0.5% 和1% 的松茸提取物處理40 天后，酪氨酸酶含量分別降至1.3、1.85、1.815 和1.59 ng/mL。

2.3 松茸提取物對人體皮膚具有美白作用

上述研究表明，松茸提取物可以抑制B16-F10 和小鼠皮膚中黑色素的產生。為了進一步確定松茸對人類皮膚色素沉著過度的美白修復功效，檢測受試者使用含有松茸提取物的面膜后，皮膚白皙程度以及光澤度改善情況。L* 值用來表征皮膚亮度，L* 值越大，代表皮膚顏色越白；ITA°值用來表征人體皮膚顏色，ITA°值越大，代表皮膚顏色越淺。如圖4A 所示，隨著松茸提取物的處理時間的增加，L*/ITA°值也隨之增加。除此之外，皮膚的光澤度也隨著松茸提取物的使用時間增加而增加。實驗結果表明松茸提取物能夠起到提亮膚色美白的效果。

2.4 GO 和KEGG 通路分析

通過分析不同組間的轉錄組數據，篩選出了3631 個差異表達基因（DEG），其中1876 個基因上調，1755 個基因下調（見圖5A）。通過更嚴格的篩選標準（|logFC|>2，P <0. 05），篩選出841 個差異表達基因（包括144 個上調基因和697 個下調基因） 進行后續的通路富集分析。

GO 術語富集分析發現，上調的DEG 在14 個GOBP、8 個GO-MF 和10 個GO-CC 中顯著富集，對細胞質、肌動蛋白細胞骨架、相同蛋白結合、鎂離子結合、凋亡過程和碳水化合物代謝過程的正調控；下調的DEG 在92 個GO-BP、49 個GO-MF 和44 個GO-CC 中顯著富集，對PML 體、染色體、著絲粒區、泛素蛋白連接酶結合、RNA聚合酶II 轉錄因子活性、細胞遷移的調節呈正向調控。差異表達基因顯著富集的KEGG 通路數據的結果也如圖5C 所示。上調的基因顯著富集了2 條與色素沉著相關的KEGG 通路，包括P13/Akt 信號通路和MAPK 信號通路。

2.5 蛋白質互作網絡分析

將松茸處理后得到的差異蛋白列表導入Cytoscape軟件中，以構建分析其蛋白在生物系統中的相互作用關系網絡。在分析松茸處理的靶向互作網絡中有841 個蛋白質映射到模型網絡中的78 個節點（見圖6A） 以及拓撲分析（見圖6B） 后發現，Ndufs6、Ndufs5、Rpl4、RplB、Rps5、Rps3、Rps18、Rps11、Rps9、Rps14、Psmb7、Psmb2、Psmb4 和Psmb6 可以作為重要的交互基因參與黑色素以及酪氨酸酶活性的調控過程。

03討論

松茸作為一種非常重要的食用菌，1000 多年來一直在醫學領域被廣泛應用。最近的一項研究表明，肉桂酸甲酯是松茸的重要成分之一，可抑制小鼠B16-F10 黑色素瘤細胞中的酶促反應和黑色素的生成，表明肉桂酸甲酯可能作為一種新的黑色素生成抑制劑[22]。然而，這項研究僅使用黑色素瘤細胞來評估肉桂酸甲酯對黑色素生成的影響，研究并不全面。此外，肉桂酸甲酯與熊果苷和曲酸具有相同的安全問題。因此，該項研究通過分析松茸這類藥用植物資源，探究植物提取物對皮膚色素沉著抑制的功效。

酪氨酸酶是黑色素生物合成的限速酶，在調節黑色素生成，酪氨酸酶在黑色素生成中發揮重要作用[23]。之前研究表明Phytoclear-EL1 大戟種子提取物，能夠降低B16-F10 黑色素瘤細胞的黑色素含量和酪氨酸酶活性[24]。當歸提取物以劑量依賴的方式顯著降低了B16-F10 中的黑色素含量和酪氨酸酶活性，可能也是一種潛在的抗色素沉著劑[25]。因此在本實驗中，我們也選擇B16-F10 細胞檢測了松茸提取物黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響。實驗結果發現松茸提取物顯著抑制B16-F10 細胞中黑色素的形成。此外，研究結果發現松茸提取物以比熊果苷更好的劑量依賴性方式抑制B16-F10 細胞中的酪氨酸酶活性?？傊扇滋崛∥锟梢酝ㄟ^抑制B16-F10 細胞中的酪氨酸酶活性來抑制黑色素的形成，并且可以作為改善色素沉著的重要自然植物資源。

隨后通過動物實驗，評估松茸提取物是否能夠抑制暴露于UVB 后的動物皮膚色素沉著。紫外線是影響皮膚黑色素類型和數量的主要外在因素。UVB 照射角質形成細胞增加了POMC（α-MSH 前體） 的表達和受體MC1-R 的表達，導致形成α-MSH、黑色素合成酶和其他信號因子表達的激活[26，27]。通過暴露于UVB 后的小鼠構建了動物皮膚的色素沉著模型，我們發現松茸提取物能夠抑制黑色素的形成并改善動物皮膚的過度色素沉著。隨后人體皮膚實驗結果表明，使用含有松茸提取物的產品后4 周發現，松茸對人體皮膚美白具有顯著效果。以上結果表明松茸提取物能夠改善小鼠皮膚和人類皮膚的色素沉著。

為了確定調控黑色素生成的關鍵基因和調控途徑并闡明松茸調控的分子機制，我們使用RNA 測序來分析完整的轉錄組。RNA 測序分析表明，松茸提取物可以影響色素沉著調控相關通路，主要作用于P13K/Akt 信號通路和MAPK 信號通路。MITF 的表達受cAMP 調節，cAMP 抑制PI3K 并刺激GSK-β 活性[28]。此外，GSK-β 刺激MITF磷酸化，增強了色素相關基因的轉錄激活和黑色素的合成[29，30]。在環己酰亞胺存在的情況下，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 激酶抑制MITF 的表達，從而使細胞外信號調節激酶（ERK）/MAPK 信號傳導參與MITF 的降解。在該調控途徑中，配體- 受體相互作用激活Ras 蛋白，從而進一步激活B-Raf 激酶和ERK1/2。MAPK 能夠磷酸化MITF 蛋白，導致MITF 的泛素化和降解，黑色素生成相關基因的表達降低[31]。此外，PPI 結果表明，松茸提取物可能通過黑色素細胞的增殖和凋亡來調節色素沉著。

綜上所述，通過體外B16-F10 細胞培養、UVB 誘導的小鼠皮膚色素沉著，以及人類皮膚中的皮膚美白效果發現，松茸提取物具有調控色素沉著、酪氨酸酶活性方面的功效。轉錄組測序分析發現松茸提取物可以通過調節P13K/Akt 信號通路和MAPK 信號通路來改善色素沉著過度，并與黑色素生成以及黑色素瘤的增殖和凋亡有關。