食蟹猴紋狀體內注射α-突觸核蛋白預制原纖維對嗅球病理改變的影響

丁雨瀟，粟璟曦，宋瓊，王麗惠，吳日寶，況昕宇，蘇迎，鄒春林，2△

帕金森病（Parkinson，PD）又名震顫性麻痹，是一種多發于老年人群的神經退行性疾病，在65歲以上老年人群中患病率達2%～3%，受到人口老齡化及環境等因素影響，預計到2040年全球患病人數將達到1 420萬［1］。目前臨床上對于PD患者的診斷大多依賴于靜止性震顫、行動遲緩、肌強直等運動癥狀，但當患者被診斷為PD 時，黑質致密部的多巴胺（Dopamine，DA）能神經元約有一半已經丟失。然而嗅覺功能障礙作為PD早期常見的非運動癥狀，通常先于運動癥狀數年發生，對于輔助PD患者盡早診斷具有重要意義［2］。α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）是一種神經元特異性突觸前膜蛋白，也是PD特征性包涵體——Lewy 小體的重要成分。α-Syn 與PD發病過程密切相關［3］。為了研究病理性α-Syn的致病機制，研究人員在體外合成了與病理性α-Syn原纖維結構高度相似的α-Syn 預制原纖維（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-Syn PFF），并將其應用于PD 細胞和動物模型的制作［4］。與傳統的神經毒素誘導的PD 模型相比，α-Syn PFF 誘導的PD 模型可以更好地模擬PD 患者的病理特征，如在黑質DA能神經元內可見病理性α-Syn 聚集和Lewy 小體樣包涵體的形成。但是目前關于α-Syn PFF 誘導的PD動物模型的研究常見于小鼠［5］，在非人靈長類動物上較少見，并且對模型動物腦組織病理改變的研究主要集中于黑質和紋狀體等腦區［6］，對嗅球損傷的研究較少。本實驗于食蟹猴雙側紋狀體注射α-Syn PFF構建模型，探討食蟹猴紋狀體內注射α-Syn PFF對嗅球病理改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5 只正常雌性食蟹猴（8～11 歲）購自廣西雄森靈長類實驗動物養殖開發有限公司，動物生產許可證號：SCXK（桂）2016-0003，并飼養于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司的非人靈長類實驗室，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0002。該實驗室已通過國際實驗動物評估和認可管理委員會（AAALAC）認證，動物房飼養溫度保持23～27 ℃，光照黑暗各12 h 循環交替，純凈飲用水持續供應，每日供給常規飼料和新鮮水果。所有涉及動物的實驗方案均得到了動物關懷與使用倫理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）的批準（倫理號：W00154）。

1.1.2 主要試劑及儀器 鼠源酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體（MAB318）購自美國Millipore 公司；兔源磷酸化α-Syn（pS129）單克隆抗體（ab51253）、兔源雙皮質素（Doublecortin，DCX）多克隆抗體（ab18723）購自英國Abcam公司；生物素化山羊抗兔二抗（BA-1000）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素工作液（SA-5004-1）、DAB 過氧化物酶底物試劑盒（含鎳，SK-4100）購自美國Vector公司；DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）、小鼠SPN 試劑盒（SPN-9002）、兔SPN 試劑盒（SPN-9001）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；尼氏染色液（C0117）購自上海碧云天生物技術有限公司。Leica冰凍切片機（LEICA CM1950）購自德國Leica公司。

1.2 模型建立 根據食蟹猴腦部磁共振影像，對3只食蟹猴施以腦立體定向注射手術，將300 μg α-Syn PFF（7 g/L）注射到雙側紋狀體的6個位點，即每側紋狀體殼核頭部注射60μg，體部注射60μg，尾部注射30μg。另2 只食蟹猴于相同部位給予同等劑量磷酸鹽緩沖液（PBS）作為對照組。觀察2年，于注射2年后，分別對5只食蟹猴靜脈注射過量的戊巴比妥鈉行安樂死，經左心室以生理鹽水灌流沖洗血管，開顱取出嗅球，并經4%多聚甲醛固定后，分別在10%、20%和30%蔗糖中梯度脫水，OCT包埋并切成14μm厚的冰凍切片。

1.3 免疫組織化學染色 冰凍切片經烤片30 min，4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液微波修復抗原，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶30 min，0.3%Triton X-100 增加細胞通透性30 min，5%羊血清封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，包括TH 抗體（1∶400）、DCX 抗體（1∶4 000）、pS129 抗體（1∶1 000），次日以0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PB）沖洗3次，孵育生物素化山羊抗小鼠或抗兔二抗90 min，0.1 mol/L PB 沖洗3次，之后孵育HRP 標記鏈霉卵白素工作液或HRP 標記鏈霉親和素工作液（1∶250）反應90 min，0.1 mol/L PB 沖洗3 次，DAB顯色或含鎳DAB底物液顯色，鏡下控制顯色時間，蒸餾水清洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。由于嗅球不同切面的切片細胞數量可能差異較大，為避免由于集中選取某一部分的切片導致細胞數的差異在對照組和實驗組每只食蟹猴嗅球切片中每間隔5 張挑取1 張，每只食蟹猴共選取5張切片，每張切片均勻地選擇5個20倍鏡下視野，利用Image J軟件計數DA和DCX陽性細胞數。

1.4 尼氏染色 切片浸入4%多聚甲醛固定20 min，蒸餾水洗滌2 min，重復1 次，之后在組織上滴加尼氏染液，放入37 ℃孵箱中染色10 min，取出后蒸餾水洗滌2 次，浸入95%乙醇分色約5 s，最后于95%乙醇中脫水2 min，重復1 次，二甲苯透明5 min，重復1次，中性樹膠封片。

1.5 統計學方法 用SPSS 23.0 軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 嗅球組織病理改變 對照組整體著色較深，顆粒細胞層（granule cell layer，GCL）與僧帽細胞層（mitral cell layer，MCL）神經元多且排列緊密，細胞輪廓清晰；實驗組整體著色較淡，GCL 與MCL 神經元數量明顯減少，MCL 排列松散，且細胞輪廓模糊，見圖1。

2.2 病理性α-Syn 可傳播至嗅球 對照組嗅球中無pS129陽性反應，實驗組嗅球存在大量pS129陽性聚集體，見圖2。

Fig.2 Immunohistochemistry staining of pS129 in olfactory bulb圖2 免疫組織化學染色嗅球組織pS129表達

2.3 α-Syn PFF 誘導嗅球DA 能神經元丟失 與對照組相比，實驗組嗅球DA 能神經元數量明顯減少。實驗組TH陽性神經元數量為（27.00±11.22）個，對照組為（65.80±36.54）個，差異有統計學意義（t=3.257，P＜0.01），見圖3。

Fig.3 The number of TH-positive neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb圖3 免疫組織化學染色檢測嗅球TH陽性神經元數量

2.4 α-Syn PFF抑制新生神經元生成 與對照組嗅球DCX陽性神經元數量［（88.30±19.89）個］比較，實驗組［（67.60±17.23）個］明顯減少，差異有統計學意義（t=2.678，P＜0.05），見圖4。

Fig.4 The number of DCX-positive new neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb圖4 免疫組織化學染色檢測嗅球DCX陽性新生神經元數量

3 討論

3.1 食蟹猴紋狀體注射α-Syn PFF 模型更具代表性 PD患病人數逐年上升，已經造成嚴重的社會醫療負擔。目前雖然已經開發了多種動物模型來研究該疾病，但每種模型都有一定的局限性［7］。以毒素為基礎的動物模型［8］主要針對PD的運動癥狀，極大地促進了其對癥治療的發展，這些模型的優點是運動癥狀表型清晰，建模時間短，可以應用于多種動物，但實驗過程中難以避免實驗者暴露，且對于腦內病理改變的再現效果較差。α-突觸核蛋白基因（SNCA）是編碼α-Syn的基因，也是家族性帕金森病重要的致病基因，基于SNCA基因突變構造了許多α-Syn轉基因動物模型，例如A53T、A30P，此類模型可復制類似于PD患者腦內α-Syn異常聚集現象，并表現出漸進的病理變化，但通常需要較長時間，且有時難以獲得目的表征。近年來病理性a-Syn的播散在PD 的發病及進展研究中日漸受到關注。越來越多的證據表明，錯誤折疊的a-Syn 會在相互連接的中樞神經系統區域之間擴散，促進疾病的進展［9］。PD 患者接受胚胎中腦DA 能神經元移植多年后，在移植神經元中檢測到了病理性a-Syn，進一步證實了其傳播性［10］。α-Syn 是由140 個氨基酸組成的小分子蛋白質，分布于突觸前神經末梢，在PD 患者中常于Ser129 位點發生磷酸化，聚集成不溶性淀粉樣原纖維。為研究病理性α-Syn 的致病機制，研究人員在體外合成了與病理性α-Syn原纖維結構高度相似的α-Syn PFF，并將其注射入野生型小鼠紋狀體，證實α-Syn PFF 可在整個腦區引起磷酸化α-Syn 病理改變［11］。這一模型對比轉基因模型建模時間較短，且PD 表型較全面，是研究PD 腦內病理改變的理想模型。非人靈長類動物食蟹猴在組織結構、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似，對食蟹猴進行研究獲得的結果能夠更好地轉化應用［12］。本研究結果顯示，α-Syn PFF 造模的食蟹猴對比對照組嗅球中存在大量磷酸化α-Syn 沉積，證明病理性α-Syn 能夠從紋狀體傳播至嗅球，引起神經元損傷。

3.2 α-Syn PFF誘導嗅球DA能神經元丟失 PD最顯著的非運動癥狀是嗅覺功能障礙，在家族性和散發性PD中均有表現，患病率為50%～96%，并且可以在運動癥狀出現之前至少5 年出現［13］。Braak 假說也提出嗅球是最早受累的部位之一，在病程早期即可出現α-Syn病理沉積，因此可作為PD早期診斷的特征之一［14］。Huisman 等［15］發現在早期PD 患者嗅球中DA能神經元數量顯著增加，而DA能神經元數量的增加導致嗅覺信息傳遞的抑制，提示嗅覺減退可能與DA 能神經元代償性增多有關。隨著病程發展，代償作用減弱，DA 能神經元數量逐漸減少。本實驗中雙側紋狀體注射α-Syn PFF誘導的食蟹猴模型2年后檢測嗅球中DA能神經元數量下降，證明病理性α-Syn可以從紋狀體注射位點傳播至嗅球并造成嗅球DA能神經元丟失，這一病理改變是否會引起食蟹猴嗅覺障礙還需進一步研究。

3.3 α-Syn PFF抑制新生神經元生成 神經元數量減少通常是由于神經元死亡增加以及新生神經元生成減少所致。已有研究表明，在成年哺乳動物的大腦中DA 調節神經前體細胞的增殖，DA 能神經元丟失后嗅球中新生神經元減少［16］。對PD 患者的尸檢結果與實驗結果一致，患者側腦室下區、海馬齒狀回顆粒下區和嗅球神經前體細胞的增生均減少，提示DA能神經元丟失可能是PD患者大腦中新生神經元生成減少的原因［17］。Winner等［18］在高表達α-Syn的轉基因小鼠海馬齒狀回中發現α-Syn異常聚積且新生神經元生成減少，表明α-Syn 的過表達能夠影響新生神經元的形成。基于以上研究基礎，本實驗探究了食蟹猴雙側紋狀體注射α-Syn PFF能否造成嗅球DA能神經元的丟失，同時伴有新生神經元生成減少。DCX 是一種微管相關蛋白,參與新生神經元的遷移和分化，可用來標記未分化成熟的神經細胞，DCX 數量的多少可以間接反映神經元生成的能力。本實驗檢測到α-Syn PFF 造模的食蟹猴嗅球中TH免疫組化染色的DA能神經元和DCX陽性細胞數均減少，說明α-Syn PFF可能通過引起DA能神經元的丟失導致新生神經元生成減少，進一步促進PD的病理進程，而其能否引起食蟹猴的側腦室下區等其他腦區出現相同的病理改變還需進一步研究。

綜上所述，本實驗利用食蟹猴雙側紋狀體注射α-Syn PFF建立模型，發現病理性α-Syn可傳播至嗅球引起神經元損傷，使嗅球中DA 能神經元大量丟失，并伴有新生神經元生成減少，這些病理改變可能與PD 的嗅覺障礙有關，為今后更好地利用α-Syn PFF建立PD模型、研究其嗅覺障礙的發病機制提供了一定基礎。