外源性心肌球樣細胞外囊泡Y RNA片段改善小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

劉德昭，羅小志，黃鋒

心肌梗死是較常見、致死率較高的一種心血管疾病，救治心肌梗死的關鍵是盡快恢復缺血心肌血供。然而，冠狀動脈血流恢復后的再灌注可能導致更嚴重的缺血心肌急性損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）［1］。MIRI 的機制包括炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙和鈣超載等［2］。MIRI 會導致心臟炎癥級聯反應，出現惡性心律失常、無復流或心肌頓抑，心肌壞死面積進一步擴大甚至死亡。Y RNA是一類長度約100 nt 的非編碼RNA，參與調控細胞生命周期的重要過程，包括DNA 復制起始、抑制RNA 結合蛋白Ro60等，其在組蛋白前體mRNA加工和細胞損傷修復中起重要作用［3-4］。最近有研究表明，心肌球樣細胞（cardiosphere-derived cells，CDCs）外囊泡在心臟保護、抗炎、血管新生中發揮重要作用。而CDCs 外囊泡富含細胞外囊泡Y RNA 片段（extracellular vesicles Y RNA fragments，EV-YF），其中EV-YF1 含量最豐富［5-7］。本課題組前期提取CDCs外囊泡EVYF1 進行分析，并人工合成EV-YF1，使用EV-YF1干預肥厚型心肌病小鼠，可介導巨噬細胞極性而抑制炎癥反應、減輕心肌細胞肥大及間質纖維化［8］。但EV-YF1對心肌缺血再灌注損傷作用機制仍不明確，本研究將探討EV-YF1是否減輕小鼠MIRI。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級成年雄性C57BL/6J 小鼠18 只，8 周齡，體質量23～28 g，購自廣西醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0003，伊文思藍和TTC 染色液購自北京索萊寶生物公司；HE組織病理染液盒和TUNEL 試劑盒購自武漢賽維爾生物科技公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物公司；cDNA 反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購于日本Takara公司；兔抗B淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）抗體、兔抗Bcl-2 相關的X 蛋白（Bax）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司、兔抗胱天蛋白酶-3（Caspase-3）抗體、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自英國Abcam公司，化學發光儀購自美國Protein Simple公司。Mini-Vent845小動物呼吸機購自美國哈佛儀器公司，電泳儀和熒光定量PCR 儀購自美國伯樂生命醫學產品有限公司，DharmaFECT4（一種專門為轉染siRNA 而優化的轉染試劑，可以滿足小片段RNA的高效轉染要求）購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EV-YF1 配制 EV-YF1 委托上海艾博思生物科技公司合成，核苷酸序列：5'-GGCUGGUCCGAUGGUAGUGGGUUAUCAGAACUUAUUAACAUUAGUGUCACUAAAGU-3'；EV-YF1 及DharmaFECT4（3∶1，避免EV-YF1 發揮作用前降解）分別加入適量無血清的培養基中，室溫放置5 min 后混勻，室溫再放置20 min后備用。

1.2.2 MIRI 模型建立及分組 將小鼠按隨機數字表法分為Sham組、MIRI組、EV-YF1組，每組6只。按0.02 mL/g經腹腔注射1.2%三溴乙醇適度麻醉。氣管切開插管后連接呼吸機，設置參數：頻率120次/min，吸呼比4∶5，潮氣量1 mL。Sham組穿針過左前降支下方不結扎，45 min 后關閉胸腔；MIRI 組與EV-YF1組左前降支結扎處放聚乙烯軟管，打活結。缺血45 min 后，松開活結開放前降支，左心室前壁蒼白心肌變鮮紅色，表明心肌組織恢復再灌注；再灌注10 min后夾閉主動脈；EV-YF1組左心室心腔內注射5μg EV-YF1確保足夠的EVYF1 進入到冠狀動脈；MIRI 組左心室注射等體積不含EVYF1的DharmaFECT4，20 s后松開主動脈夾。關閉胸腔，小鼠恢復自主呼吸后拔出氣管導管，醒后放回飼養處。

1.2.3 伊文思藍/TTC雙染色檢測心肌梗死面積 再灌注24 h后，將麻醉狀態小鼠接入呼吸機，充分暴露心臟及主動脈，沿結扎線同一切跡再次結扎左前降支，經右心室緩慢注射2%伊文思藍，直到左心耳組織全部藍染后停止注射，用血管鉗夾閉主動脈數秒，用無齒鑷輕夾心臟促進染液灌注。待小鼠心臟完全停跳，關閉呼吸機，迅速剪取心臟，浸入PBS 中沖洗，紗布裹干，滴加冰凍包埋液覆蓋心臟放入-20 ℃冰箱冷凍固定。心臟固定期間，將1%TTC 染液于恒溫箱內溫育至37 ℃。固定液顏色變白后取出心臟，沿左心室表面結扎線下緣水平，切取2 mm厚度的橫截面組織，用PBS將組織搖洗片刻，稍壓平卷曲的組織片。將組織片放入1%TTC 染液中避光下浸潤10 min，中間翻面一次使脫氫酶充分反應。用PBS沖洗組織片殘余染液，放入4%多聚甲醛中固定24 h。通過Image J 軟件測量MIRI 后危險區域比值及梗死面積比值，其中藍染部分為正常組織，未藍染部分為心肌缺血危險區域，無法浸染呈灰白色部分為梗死區域。

1.2.4 HE染色觀察心肌組織病理學形態 將心肌組織固定于4%多聚甲醛，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切成厚度約5μm的切片，二甲苯中常規脫蠟，梯度乙醇水化。使用蘇木素染色10 min，沖洗掉表面多余染液，1%鹽酸-乙醇分化數秒，再加入伊紅染色液染色1 min，經梯度乙醇脫水與二甲苯透明后，使用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 ELISA 檢測外周血清IL-1β、IL-6、TNF-α 再灌注24 h后，給予小鼠過量麻醉（標準用量1倍以上），再次氣管插管接呼吸機，經右心室采集靜脈血約0.8 mL，室溫下將其靜置30 min，離心機以1 500 r/min 低溫離心10 min，分離出血清，采用ELISA 試劑盒檢測小鼠外周血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平。

1.2.6 qPCR 檢測心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達 取20 mg 心肌組織，加入TRIzol 試劑提取總RNA，測定RNA 濃度，并進行擴增反應。取1 μg 總RNA 反轉錄生成cDNA，反應體系為20μL：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 1 μg，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix I 1μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，RNase Free dH2O 10μL；反應條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。通過檢測熔解曲線曲線來驗證引物的特異性。采用2-ΔΔCt法計算IL-1β、IL-6、TNF-α 經內參GAPDH標化后的相對表達量，每個樣本重復3次取平均值。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.7 Western blot 檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達 使用RIPA裂解液提取心肌組織中的總蛋白后使用BCA法進行定量，上樣于10%預制的SDS-PAGE 凝膠中進行電泳及轉膜。5%BSA溶液室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗10～14 h，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，使用化學發光儀曝光得到蛋白條帶，使用Image J系統分析條帶灰度。

1.2.8 心肌細胞凋亡的TUNEL 染色檢測 心臟取材后，沿左心室表面結扎線下緣水平切取心肌組織進行包埋，石蠟切片進行常規脫蠟、水化，蛋白酶K消化處理，滴加TUNEL反應混合液，置于濕盒內，37 ℃避光孵育60 min。滴加DAPI溶液染核2 min。在熒光顯微鏡下觀察并記錄組織切片TUNEL核染陽性細胞數。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2進行數據分析，計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EV-YF1對小鼠心肌缺血再灌注后梗死面積的影響 伊文思藍/TTC雙染色結果顯示，Sham組僅可見造模穿刺點附近輕微白色梗死灶，MIRI 組、EVYF1 組均可見明顯梗死區域；與MIRI 組相比，EVYF1組小鼠MIRI后梗死面積比值縮小（P＜0.05），各組間小鼠MIRI后危險區域比值差異無統計學意義，見圖1、表2。

Fig.1 Changes of risk area and infarct size in mice after MIRI in each group(Evans Blue/TTC double staining)圖1 各組小鼠MIRI后危險區域與梗死面積變化（伊文思藍/TTC雙染色）

Tab.2 Comparison of infarct area ratio and risk area ratio after MIRI between the three groups of mice表2 各組小鼠MIRI后梗死面積比值與危險區域比值比較（n=6，%，）

Tab.2 Comparison of infarct area ratio and risk area ratio after MIRI between the three groups of mice表2 各組小鼠MIRI后梗死面積比值與危險區域比值比較（n=6，%，）

＊＊P＜0.01；a 與Sham 組比較，b 與MIRI 組比較，P＜0.05；表3—5同。

組別Sham組MIRI組EV-YF1組F梗死面積比值2.89±0.38 48.48±1.21a 33.86±0.86ab 693.900＊＊危險區域比值56.92±1.35 57.42±1.44 58.59±0.67 0.508

2.2 EV-YF1 對IR 小鼠心肌組織病理學形態的影響 HE 染色結果顯示，Sham 組心肌組織結構未見異常，纖維核飽滿居中，呈橢圓形，細胞無腫脹、脂肪變性及壞死等改變；MIRI 組心肌組織損傷明顯，表現為大量纖維核溶解消失，核碎片不規則分布，肌纖維明顯腫脹，呈波浪形，部分肌纖維發生斷裂，肌漿凝集，組織間隙疏松。與MIRI組相比，EV-YF1組心肌損傷減輕，見圖2。

Fig.2 HE staining of mouse hearts in three groups(×200)圖2 各組小鼠心臟HE染色（×200）

2.3 EV-YF1對小鼠心肌缺血再灌注后血清和心肌組織炎性因子水平的影響 與Sham 組比較，MIRI組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平上調（P＜0.05）；與MIRI 組比較，EV-YF1 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平降低，見表3。qPCR 結果顯示，與Sham組相比，MIRI 組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達升高（P＜0.05）；EV-YF1 組心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平較MIRI組下降（P＜0.05），見表4。

Tab.3 Comparison of inflammatory factors in peripheral blood between the three groups of mice表3 各組小鼠外周血炎性因子水平比較（n=6，ng/L，）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors in peripheral blood between the three groups of mice表3 各組小鼠外周血炎性因子水平比較（n=6，ng/L，）

組別Sham組MIRI組EV-YF1組F IL-1β 86.2±5.9 482.3±35.8a 350.1±21.0ab 69.480＊＊IL-6 257.7±25.9 753.7±31.5a 494.8±25.8ab 79.230＊＊TNF-α 235.5±19.4 815.6±28.1a 516.7±34.4ab 107.600＊＊

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in myocardial tissue between the three groups of mice表4 各組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in myocardial tissue between the three groups of mice表4 各組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平比較（n=6，）

組別Sham組MIRI組EV-YF1組F 1.00±0.08 8.98±0.42a 2.29±0.31ab 197.900＊＊1.00±0.13 2.43±0.01a 1.39±0.04ab 56.190＊＊1.00±0.26 3.93±0.45a 1.56±0.22ab 22.630＊＊IL-1βIL-6TNF-α

2.4 EV-YF1 對小鼠心肌組織Bax、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白水平的影響 蛋白免疫印跡實驗結果顯示，與Sham組比較，MIRI組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；與MIRI 組比較，EVYF1 組Bcl-2 蛋白表達水平升高，而Bax 和Caspase-3 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表5。TUNEL 染色結果顯示，Sham 組未見TUNEL 核染陽性細胞；與Sham組相比，MIRI組TUNEL核染陽性細胞數量明顯增多；與MIRI 組相比，EV-YF1 組TUNEL核染陽性細胞數量減少，見圖4。

Fig.3 Bax,Bcl-2,Caspase-3 protein expression levels in mouse myocardial tissue圖3 小鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平

Fig.4 TUNEL staining results of myocardial tissue in each group(×400)圖4 各組心肌組織TUNEL染色結果（×400）

Tab.5 Comparison of relative expression of apoptosisrelated proteins in myocardial tissue between the three groups of mice表5 各組小鼠心肌組織凋亡相關蛋白相對表達量比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of relative expression of apoptosisrelated proteins in myocardial tissue between the three groups of mice表5 各組小鼠心肌組織凋亡相關蛋白相對表達量比較（n=6，）

組別Sham組MIRI組EV-YF1組F Bcl-2 0.360±0.034 0.720±0.034a 2.757±0.209ab 109.600＊＊Bax 0.905±0.059 1.542±0.125a 1.054±0.144ab 8.379＊＊Caspase-3 0.248±0.028 0.899±0.085a 0.648±0.078ab 23.060＊＊

3 討論

MIRI是一個復雜的病理過程，越來越多的證據表明，炎癥和凋亡反應在MIRI過程中扮演著重要角色［9-10］。因此，抑制MIRI 后炎癥反應和細胞凋亡具有重要意義。CDCs 是第二心區發育過程中殘留的細胞，該類細胞外形小、圓且明亮，形成類似克隆樣的心肌球；當心臟發育成熟后這些細胞可繼續存在成體心臟細胞間質中；心肌損傷后，CDCs 參與心臟的自我修復和更新。多項臨床研究證明CDCs 治療心肌梗死及擴張型心肌病患者具有較好的安全性和有效性［11-13］。研究表明，CDCs 能通過分泌EV-YF1抑制心肌炎癥、減輕心肌細胞凋亡和纖維化，并促進血管生成［14-16］。EV-YF1 雖然來源于先前存在的非編碼RNA，但其本身可能具有生物活性。

炎癥反應是再灌注損傷的關鍵。MIRI 后的炎癥反應主要以巨噬細胞浸潤為主。活化的促炎型M1 巨噬細胞會通過吞噬和降解方式清除壞死的細胞碎片，并分泌IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子［17］。研究表明，對心肌梗死大鼠心腔注射10 μg EV-YF1 可調控巨噬細胞分化為修復型M2 巨噬細胞，促進受損心肌表達和分泌抗炎因子IL-10，同時抑制促炎細胞因子TNF、IL-6的釋放，減少梗死面積并引發抗凋亡反應［18］。此外，對肥厚型心肌病以及高血壓引起的心血管疾病給予EV-YF1治療均發現EV-YF1 可誘導巨噬細胞快速激活，抑制促炎因子分泌，從而減輕心臟的炎癥［8，16］。據此筆者推測EVYF1 在抑制MIRI 炎癥中可能發揮同樣的作用。本研究結果提示，與Sham組相比，MIRI 組小鼠血清和心肌組織中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平明顯增加，而使用EV-YF1 干預可降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達，提示EV-YF1 可抑制炎癥反應，保護缺血心肌細胞。

細胞凋亡是細胞程序化死亡的主要模式，在組織內穩態的發展和維持中發揮著重要作用。凋亡蛋白激酶Caspase-3 是凋亡途徑中的關鍵效應物，TNF-α、IL-1β 等多種炎性因子可以與相應的受體結合，激活Caspase-3，引起細胞凋亡［19-20］；線粒體凋亡分子中的Bcl-2 家族包括抗凋亡基因Bcl-2 和促凋亡基因Bax，它們均參與了再灌注損傷的凋亡過程［21］。Gallet等［5］研究表明，向心肌梗死后的豬心臟輸注CDCs 外囊泡可以改善癥狀，減少受損心肌凋亡；CDCs 外囊泡可降低損傷心肌細胞中Caspase-3表達，抑制細胞凋亡［22］。然而，對于外囊泡中發揮有益作用的成分仍不明確。本研究結果提示，在MIRI小鼠心肌組織Bcl-2，Bax、Caspase-3 的表達均明顯升高，而EV-YF1 降低MIRI 小鼠Bax、Caspase-3 凋亡因子表達水平，上調抗凋亡因子Bcl-2 的表達水平。此外，TUNEL 染色證實EV-YF1 可明顯抑制心肌細胞凋亡。根據這一結果筆者推測EV-YF1可能在改善心臟細胞凋亡中發揮有益作用。

綜上所述，CDCs外囊泡Y RNA片段EV-YF1可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 炎性因子相關通路，抑制MIRI 后的細胞凋亡，進而維持心肌細胞活性，改善小鼠MIRI。本研究為進一步的機制探討提供了參考依據和方向，為MIRI的防治提供了新的精準干預靶點。