不同前處理-GFAAS法測定葡萄酒中銅、鐵元素含量的技術研究

蔣娟，劉宇航，梁艷英,3，張予林,3*

（1. 西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2. 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100；3. 西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站，陜西合陽 715300）

葡萄酒中含有氨基酸、維生素以及多種礦質元素（包括微量元素），是一種營養(yǎng)豐富的飲料，適當飲用有延緩衰老、益壽延年的效果[1]。葡萄酒中的Cu2+、Fe3+是氧化還原系統(tǒng)的重要因子，在葡萄酒陳釀中發(fā)揮重要作用，對葡萄酒的澄清和風味有很大影響。但過量的銅（Cu）會影響酒體的穩(wěn)定性，加快葡萄酒氧化，使酒體產(chǎn)生渾濁和沉淀，影響酒的色澤和口感[2]；過量的鐵（Fe）可與白葡萄酒中的磷酸鹽或紅葡萄酒中的單寧形成難溶性物質，導致葡萄酒渾濁，產(chǎn)生鐵破敗病[3-4]。因此，葡萄酒中Cu、Fe元素含量的準確測定對于葡萄酒釀造和毒理學方面的研究具有重要意義[5]。

國家標準GB/T 15037—2006規(guī)定[6]，葡萄酒中Fe含量不超過8.0 mg·L-1，Cu含量不超過1.0 mg·L-1。目前，常用于Cu、Fe元素含量測定的方法主要包括火焰原子吸收光譜法（FAAS）[7]、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）[8]、毛細管電泳法和石墨爐原子吸收光譜法（GFAAS）[9]等。其中GFAAS具有靈敏度高、檢出限低、進樣體積少、減少化學干擾、原子化效率高的優(yōu)點，在食品重金屬元素測定中被廣泛應用[10]。本實驗對GFAAS測定葡萄酒中Cu、Fe元素的灰化溫度、原子化溫度條件進行研究，對比濕法消解法、干法消解法、直接稀釋法3種不同前處理方法的優(yōu)缺點，擬建立一套測定葡萄酒中Cu、Fe元素含量準確、高效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：干紅葡萄酒，干白葡萄酒成品。

試劑：Cu、Fe標準溶液質量濃度均為1000 mg·L-1，來自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；濃硝酸65%～68%（Vol），優(yōu)級純，洛陽昊華化學試劑有限公司；濃鹽酸36%～38%，優(yōu)級純，四川西隴科學有限公司；實驗用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；儀器洗針液為0.5%（Vol）硝酸溶液。

試驗中所使用玻璃和塑料器材等均用20%HNO3（Vol）浸泡24 h，直接用純水清洗后晾干，再重復以上步驟一次后待用。瓷坩堝浸泡沖洗后在馬弗爐中空燒6 h。

儀器設備：AA240Z安捷倫石墨爐原子吸收光譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；SX-5-12數(shù)顯馬弗爐（箱式電阻爐），北京科偉永鑫實驗儀器設備廠；海能SH230N重金屬消解儀；昆山舒美KQ-250E超聲波清洗器；恒溫水浴鍋；可調式電熱爐。

1.2 標準溶液配制

吸取適量單元素標準貯備液，用0.5%硝酸溶液逐級稀釋至200 μg·L-1，由原子吸收自動進樣器稀釋至Cu、Fe標準系列溶液濃度，各元素質量濃度范圍見表1。

表1 Cu、Fe元素標準溶液質量濃度Table 1 Mass concentrations of standard solutions for Cu and Fe μg·L-1

1.3 樣品前處理

1.3.1 濕法消解法

吸取10 mL酒樣置于50 mL消解管中，放入重金屬消解儀中120 ℃加熱蒸發(fā)乙醇濃縮至4～5 mL，加入8 mL硝酸，設置加熱溫度為160～180 ℃，消解至無大量黃煙冒出，取下后加入2 mL過氧化氫，繼續(xù)消解至消化液呈透明略帶黃色，趕酸至剩余3～4 mL溶液，取下放冷后將消化液轉移至25 mL容量瓶中，用0.5%硝酸溶液少量多次洗滌消解管，合并洗滌液于容量瓶中定容。同時做空白試驗[11]。Fe元素測定時需再稀釋10～20倍。

1.3.2 干法消解法

準確移取酒樣10.0 mL于坩堝中，恒溫水浴鍋80 ℃條件下蒸干酒樣，然后放至可調式電熱爐上小火炭化至無煙冒出后，轉移至箱式電阻爐（馬弗爐）550 ℃灰化4～5 h。冷卻，取出。加2 mL硝酸溶液（1+1）溶解，移入50 mL容量瓶中，用水洗滌坩堝，洗滌液并入容量瓶中，加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。

1.3.3 直接稀釋法

取1 mL樣品于50 mL塑料容量瓶中，加入2 mL 5%硝酸反應10 min后定容至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。

1.4 儀器測定條件

實驗中選擇Fe的測定波長是372.0 nm，狹縫寬度0.2 nm，燈電流5.0 mA；Cu的分析波長是327.4 nm，狹縫寬度0.5 nm，燈電流4.0 mA。進樣體積為10 μL，以高純氬氣為保護氣體。

選用表1中配置的40 μg·L-1Cu標準溶液和80 μg·L-1Fe標準溶液作為測試溶液，在不加基體改進劑的情況下，通過測定標準溶液的吸光度與灰化溫度、原子化溫度的關系來選定最佳灰化溫度和最佳原子化溫度。

1.5 方法評價

1.5.1 方法的靈敏度

通過檢測限LOD（產(chǎn)生高于系統(tǒng)噪聲水平可檢測到響應的最低分析物濃度）、定量限LOQ（可準確和精確測量分析物的最低水平）和標準曲線的斜率（S）評估方法的靈敏度[12]。

LOD=3σ/S

LOQ=10σ/S

其中：σ代表空白樣品多次測量值的標準差（n=12），S代表分析曲線斜率。

1.5.2 方法的準確度

為了驗證不同前處理方法測定結果的可靠性，選取干紅、干白酒樣各一款加入一定量的待測物質，然后與樣品同時進行前處理和測定實驗，計算加標回收率。

加標回收率（%）= (C1－C0)/C'×100

式中：C1代表加標后樣品中的金屬濃度，C0代表加標之前樣品中的金屬濃度，C'代表加到酒中的分析物的標準濃度[12]。

每種金屬的加標濃度各設低、中、高三個水平，其中Fe元素按照低、中、高水平加標濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1；Cu元素的低、中、高加標濃度分別為100、200、300 μg·L-1。

選擇白、紅葡萄酒各一款，利用新建方法對樣品中Fe和Cu元素含量重復測定6次，計算相對標準偏差（RSD，%），評估方法的精密度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

借助數(shù)據(jù)處理軟件DPS V6.50 獲得實驗數(shù)據(jù)的單因素方差分析結果（Duncan新復極差法），每個處理重復6次。利用Microsoft excel 2010和Origin 2018進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 儀器工作條件優(yōu)化

2.1.1 Cu的灰化溫度和原子化溫度的選擇

石墨爐升溫過程可分為4個階段，即干燥、灰化、原子化和凈化。干燥溫度一般稍高于溶劑沸點，目的是除去溶劑，以免溶劑在灰化和原子化階段的飛濺。灰化即保證被測元素在無損失的前提下，盡量除去樣品中易揮發(fā)的基體和有機物，以減少甚至完全消除基體干擾[11]。在實際應用中，選擇被測元素不損失的最高溫度。在原子化階段，選用達到最大吸收信號的最低溫度作為原子化溫度，同時應該使用最大升溫速率使石墨管溫度上升至設定的原子化溫度。如圖1所示，Cu的最佳灰化溫度是600 ℃，最佳原子化溫度是2300 ℃。

圖1 Cu的灰化溫度和原子化溫度的選擇Figure 1 The ashing temperature and atomization temperature for Cu

2.1.2 Fe的灰化溫度和原子化溫度確定

通過測定不同灰化溫度和原子化溫度下80 μg·L-1Fe標準溶液的吸光度（圖2），確定Fe的灰化溫度是600 ℃，最佳原子化溫度是 2300 ℃。因此，本次實驗石墨爐升溫程序見表2。

圖2 Fe的灰化溫度和原子化溫度的選擇Figure 2 The ashing temperature and atomization temperature for Fe

表2 測定Cu、Fe元素的石墨爐加熱程序Table 2 Heating program of graphite furnace for determining Cu and Fe

2.2 標準工作曲線和靈敏度

2.2.1 標準曲線的繪制

設置進樣量20 μL，按表2升溫程序測定Cu、Fe標準系列溶液，得到Cu、Fe標準曲線。Cu標準曲線為y=0.0042x＋0.0319（圖3），斜率為0.0042，截距為0.0319，決定系數(shù)R2為0.9974；Fe標準曲線為y=0.0023x＋0.0078，斜率為0.0023，截距為0.0078，決定系數(shù)R2為0.9979，說明在所設質量濃度范圍內線性關系良好，且Cu標準曲線的截距更大，說明用石墨爐原子吸收光譜法測Cu的靈敏度更高。

圖3 Cu 標準溶液的標準曲線Figure 3 Standard curve of standard solution for Cu

圖4 Fe 標準溶液的標準曲線Figure 4 Standard curve of standard solution for Fe

2.2.2 檢出限及定量限

通過測定12次空白的標準差，并除以分析曲線的斜率S可知，Cu、Fe的LOD值分別是0.58 μg·L-1和1.15 μg·L-1，LOQ值分別是1.94 μg·L-1和3.85 μg·L-1。說明用石墨爐法測定葡萄酒中Cu、Fe元素含量的靈敏度較高。

2.3 不同前處理比較

2.3.1 不同前處理方式測定結果比較

選用已知本底值的干紅、干白酒樣，進行3個不同添加水平的加標回收實驗，每個水平平行測定6次，計算RSD，結果見表3和表4。

表3 不同前處理方法測定Cu元素含量的比較（n = 6）Table 3 The comparison of measured Cu based on different sample pretreatment methods

表4 不同前處理方法測定Fe元素含量的比較（n=6）Table 4 The comparison of measured Fe based on different sample pretreatment methods

由表3、表4可知，除干紅酒樣不同前處理方法間Cu的含量差異明顯外，其余不同前處理間本底值無顯著性差異。采用3種前處理方法測定Cu、Fe元素的加標回收率分別為90.37%～114.03%和86.85%～118.99%，Cu的加標回收率更接近100%，表明用石墨爐原子吸收光譜法測葡萄酒中Cu的準確度高于測Fe。對比不同前處理方法發(fā)現(xiàn)，濕法消解法測Cu的回收率略高，在90.37%～108.15%，較其他兩種前處理方法有較高的準確度。濕法消解、干法消解、直接稀釋3種前處理方法測得Fe的加標回收率分為在93.64%～118.99%、86.85%～118.31%、95.59%～116.86%，3種前處理方法間沒有明顯的差別。

3種前處理方法均有較好的精密度（即較低的RSD），在5%以內。對于Cu元素，3種前處理方法RSD平均值大小順序為濕法消解法（1.48%）＜干法消解法（2.27%）＜直接稀釋法（3.64%）；對于Fe元素，3種前處理方法RSD平均值大小順序為濕法消解法（2.00%）＜直接稀釋法（2.40%）＜干法消解法（2.79%）。因此，濕法消解法測定Cu、Fe元素的精密度高于其他兩種前處理方法，可能是由于干法消解法和直接稀釋法在操作過程中誤差較大，而濕法消解法雖然會引入較多的強酸，但趕酸的步驟消除了引入HNO3帶來的誤差，使得測得結果的精密度相對較高。

2.3.2 不同前處理方法的基本操作條件對比

由表5得知，干法消解法耗時最長，操作馬弗爐存在高溫危險，不適用大批量的分析，且在干法消解過程中坩堝壁的粘附和硅酸鹽形成有可能造成待測元素損失。直接稀釋法省時，環(huán)境污染少，操作簡單，但是由于直接稀釋法處理的試液粘度大，會出現(xiàn)堵塞儀器進樣針的問題。濕法消解法儀器設備簡單，使用強酸消解，操作耗時短，適用于大批量分析，在操作條件上明顯優(yōu)于干法消解法和直接稀釋法。

表5 不同前處理方法的基本操作條件對比Table 5 Comparison of basic operating conditions for different digestion methods

表6 葡萄酒樣品中Cu、Fe含量測定結果（n=6）Table 6 The measured concentrations of Cu and Fe in wine samples

綜合以上試驗結果，濕法消解法測得Cu的精密度和加標回收率明顯優(yōu)于其他兩種前處理方法，且濕法消解法操作方便快捷，是測定葡萄酒中Cu的較為滿意的前處理方式。而關于Fe元素的測定，3種前處理方法測得的結果都較為滿意，但是濕法消解法在操作條件上有明顯優(yōu)勢，因此三者相比，也應該選用濕法消解法作為測定葡萄酒中Fe的前處理方法。

2.4 樣品分析

選用濕法消解-石墨爐原子吸收光譜的方法，對國內外10個品種的紅白葡萄酒進行分析，Cu含量在13.40～283.63 μg·L-1，F(xiàn)e含量在668.83～3380.25 μg·L-1，所有樣品的Cu、Fe含量均符合葡萄酒國家標準中的限量標準[6]。RSD在1.16%～5.90%，測量精密度高。

3 結論

干法消解法的特點是操作相對簡單，幾乎不需要添加其他試劑，樣品受污染可能性小，Cu空白值很低。但是低溫炭化處理和550 ℃下灰化處理所需時間太長，不宜大批量進行檢測，并且高溫容易造成部分元素損失，且灰化時瓷坩堝容易形成難溶的復雜硅酸鹽，對Cu、Fe元素的測定結果影響較大。

直接稀釋法省時，環(huán)境污染少，操作簡單，也是測定葡萄酒中重金屬元素的主要前處理方法之一[17]。但由于葡萄酒基體復雜，存在消解不完全的風險，稀釋倍數(shù)較小時由于試液黏度大還會影響進樣精度，使得測得結果誤差較大。

濕法消解法所用儀器設備簡單，較干法耗時短，消解過程中不易損失金屬元素，消解過程容易控制，適用于大批量分析。本實驗選用HNO3+H2O2消解，消解完全，測定結果準確度高，是一種適用性較廣且較理想的前處理方法。用石墨爐原子吸收光譜按表2升溫程序進行葡萄酒中Cu、Fe元素測定，采用濕法消解前處理方法，測定結果良好，檢出限低，相對標準偏差小，加標回收率高，適用于葡萄酒中Cu、Fe元素的測定。