陸地棉2-酮戊二酸依賴型氧化酶GhAOP2-like基因的克隆和功能分析

李 丹,趙存鵬,劉素恩,王凱輝,張曉慧,趙麗英,郭寶生,耿軍義

(河北省農林科學院 棉花研究所,農業農村部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室,國家棉花改良中心河北分中心,河北 石家莊 050051)

2-酮戊二酸依賴型氧化酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,2OGD)基因超級家族是參與植物代謝的最大基因家族之一,主要參與天然產物的氧化過程,尤其是萜類化合物[1]。2OGD通常使用亞鐵Fe(Ⅱ)作為輔因子,2OG和O2作為輔助底物,產生副產物CO2和琥珀酸鹽(R+2OG+O2→ R-OH+琥珀酸鹽+CO2)[2]。2OGD的這種催化反應與多種生物過程有關,包括脯氨酸羥基化、核酸和組蛋白的氧化去甲基化以及許多代謝物的生物合成[2]。

Kawai等[2]對6種植物中的479個2OGD進行了系統發育分類。根據氨基酸序列的相似性,將其分為3類:DOXA、DOXB和DOXC。DOXA類包括大腸桿菌AlkB的植物同源物,它是參與烷基化核酸和組蛋白氧化去甲基化的2OGD的原型[2-3]。DOXB類在所有植物類群中都是保守的,并參與細胞壁蛋白質合成中的脯氨酸4-羥基化[2,4]。DOXC類參與各種植物化學物質的代謝,包括赤霉素、花青素、類黃酮、生長素、硫代葡萄糖苷等[1-2]。

硫代葡萄糖苷(Glucosinolates,GSL)是主要存在于十字花科植物中的一種次生代謝物質。近年研究表明,GSL在十字花科植物應對生物脅迫和非生物脅迫中具有重要作用[5]。GSL可分為3類:脂肪族GSL、吲哚族GSL和芳香族GSL[6]。AOPs是脂肪族GSL的合成基因[7],屬于DOXC類[1],其中AOP2及其同源基因已被證明參與烯基GSL(脂肪族GSL中的一種)生物合成[8-12]。Kliebenstein等[8,10]發現,功能性AOP2的表達與烯基GSL的積累之間存在完全相關。

干旱和鹽漬是影響植物生長和農作物產量的重要環境因子[13]。本研究前期測定了耐旱耐鹽品種冀2658在干旱和鹽脅迫下12,24 h的根蛋白質組,發現GhAOP2-like(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase AOP2-like)蛋白在2種處理下均上調表達,說明GhAOP2-like在陸地棉響應干旱和鹽脅迫時具有重要功能。但是,關于AOP2的功能研究主要集中在十字花科植物中,錦葵科中尚未見報道。所以研究陸地棉中GhAOP2-like響應干旱和鹽脅迫的機制具有重要意義,同時也是對AOP基因家族功能的完善。為了解析GhAOP2-like響應脅迫的機理,對GhAOP2-like進行了克隆和初步功能研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河北省農林科學院棉花研究所培育的耐旱耐鹽棉花(Gossypiumhirsutum)品種冀2658。

1.2 基因克隆

利用COTTONOMICS(http://cotton.zju.edu.cn/)網站上在線軟件將包含GhAOP2-like序列前后各2 000 bp的一段序列提取出,用軟件Premier 5在GhAOP2-like序列前后設計引物,以冀2658的cDNA為模板進行基因克隆。引物序列:Forward primer:ATGGGTGTCCAAGCTGAAATT;Reverse primer:TTAATTGGAAATTGGTGGTGAGA。

1.3 生物信息學分析

GO富集分析用Gene Ontology數據庫(http://www.geneontology.org/)。用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白進行理化性質分析;用SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分別對蛋白的信號肽及跨膜結構進行預測;用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=np%20sa_sopma.html)和Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別對蛋白進行二級結構和3D模型預測。利用PSI(http://bis.zju.edu.cn/psi/)進行GhAOP2-like的亞細胞定位預測。利用NCBI上PSI-BLAST Iteration 1程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)對序列進行Blast比對,用Fast Minimum Evolution方法進行聚類分析。

1.4 試驗材料的干旱脅迫、鹽脅迫和激素處理

將冀2658種子種植在滅菌的沙子中,待子葉展開,將幼苗輕輕取出,沖洗干凈根部后,將植株移到水培裝置中,培養至二葉一心時期,取植株的根、莖和葉片進行GhAOP2-like組織特異性表達分析,每個組織設置3個生物學重復;剩余植株進行干旱脅迫、鹽脅迫和激素處理。模擬干旱脅迫用25.16%的PEG-6000溶液,鹽脅迫用150 mmol/L NaCl溶液。為了避免2種脅迫因溶液滲透壓不同引起的試驗誤差,本試驗所用溶液的濃度在室溫25 ℃下的滲透壓基本相等,PEG-6000溶液的滲透壓計算見參考文獻[14]。激素處理濃度分別為100 μmol/L ABA、100 μmol/L MeJA、150 μmol/L GA3。取處理后0,6,12,24,48 h的幼苗根部提取RNA進行qRT-PCR驗證GhAOP2-like表達量的變化,每個時間點取3個生物學重復。

1.5 RNA提取和qRT-PCR驗證

用BioFlux Plant Total RNA Extraction Kit(DNA-free)試劑盒(購自BioFlux)按照說明書制備總RNA。第一鏈cDNA合成和qRT-PCR分別采用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(均購自諾唯贊)進行,在BIO-RAD CFX96實時系統中進行qRT-PCR?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt方法分析,試驗進行3次技術重復,用軟件SPSS 進行顯著性差異分析,以棉花Actin1作為參考基因。定量引物序列為:GhAOP2-like:Forward primer:TGGAAAGGAAACAAAAGAACGC;Reverse primer:CCAAGTCCAAAGCCTTCATACAAC。Actin1:Forward primer:ATCCTCCGTCTTGACCTTG;Reverse primer:TGTCCGTCAGGCAACTCAT。

2 結果與分析

2.1 GhAOP2-like的篩選

本研究前期利用TMT(Tandem Mass Tags)技術對干旱和鹽脅迫12,24 h的根部蛋白質組進行了分析。結果發現,GhAOP2-like在2種脅迫下均呈現上調表達的趨勢,且差異表達倍數較高,表達水平穩定(表1)。GO富集分析顯示,GhAOP2-like參與氧化還原過程。此外,利用Cotton Omics Database(http://cotton.zju.edu.cn/download.html)中TM-1_V2.1-CDS數據進行Blast比對獲得TM-1中GhAOP2-like基因序列,TM-1_v2.1_final.annotation中數據顯示GhAOP2-like參與萜類合成。

表1 GhAOP2-like在干旱和鹽脅迫下的差異表達倍數Tab.1 The FC value of GhAOP2-like under drought and salt stresses

2.2 GhAOP2-like的克隆

利用同源克隆法從冀2658中克隆得到GhAOP2-like的CDS序列(圖1-A),序列全長972 bp,編碼323個氨基酸。選取TM-1_V2.1-CDS數據庫進行Blast比對,發現GhAOP2-like位于D13染色體上,并與G.raimondii-CDS數據庫中GhAOP2-like序列完全一致。

A.GhAOP2-like基因PCR擴增產物的電泳;B.GhAOP2-like蛋白三維模型。M.DNA分子量標記;G.GhAOP2-like 的CDS條帶。A.Electropherogram of PCR amplified product of GhAOP2-like;B.3D model of GhAOP2-like protein.M.DNA Marker;G.CDS sequence of GhAOP2-like.

2.3 GhAOP2-like蛋白的生物信息學分析

利用ExPASy-ProtParam分析得到GhAOP2-like蛋白的分子式為C1654H2525N429O478S19;分子質量為36.676 97 ku;理論等電點為5.20;總親水性平均數為-0.223;不穩定指數為42.71。GhAOP2-like蛋白包含323個氨基酸,其中亮氨酸占8.4%,谷氨酸占8.4%,絲氨酸占7.1%,甘氨酸占6.8%。

預測顯示,GhAOP2-like不含信號肽,不含跨膜結構域。二級結構中,α-螺旋占8.55%,延伸主鏈占32.02%,無規則卷曲占53.29%,β-折疊占6.14%。3D模型預測如圖1-B,模型的置信度達到100%,氨基酸序列的覆蓋度達到93%,因此,可以認為該蛋白結構的預測是可靠的。PSI結果顯示GhAOP2-like定位在細胞質中。

2.4 GhAOP2-like氨基酸同源序列的聚類分析

利用NCBI上CPSI-BLAST Iteration 1程序對GhAOP2-like的氨基酸序列進行Blast比對,用Fast Minimum Evolution方法對比對到的部分序列進行聚類分析。從圖2看出,棉屬與其他物種的AOP序列明顯被分成2組,但是與同樣來自錦葵科的木槿(Hibiscussyriacus)的AOP序列關系最近。來源于棉屬的AOP1和AOP2序列被明顯分開,但序列之間差異較小。

圖2 GhAOP2-like蛋白與同源序列的聚類分析Fig.2 The cluster analysis of GhAOP2-like protein sequence and its homologous sequences

2.5 GhAOP2-like組織特異性表達

取植株的根、莖、葉片和發育中的種子進行GhAOP2-like組織特異性表達分析,如圖3-A所示,GhAOP2-like在根中表達量最高,推測GhAOP2-like可能對根部發育具有重要作用。為了進一步驗證GhAOP2-like在不同組織中的表達量,在Cotton Omics Database搜索了TM-1和海7124中GhAOP2-like的組織表達,發現GhAOP2-like同樣在根中表達最高(表2)[15]。

A.GhAOP2-like組織特異性表達分析;B.干旱處理;C.鹽處理;D.ABA處理;E.GA3處理;F.MeJA處理。不同小寫字母代表不同組織或不同處理時間的差異顯著性(P<0.05)。A.The tissue-specific expression analysis of GhAOP2-like;B.Drought treatment;C.Salt treatment;D.ABA treatment;E.GA3 treatment;F.MeJA treatment.Different lowercase letters indicate signnificant differences among different tissues or different treatment times(P<0.05).

表2 TM-1和海7124中GhAOP2-like在不同組織中的相對表達Tab.2 Relative expression level of GhAOP2-like from TM-1 and Hai 7124 in different tissues

2.6 干旱、鹽脅迫以及激素處理下GhAOP2-like表達量變化

用qRT-PCR對干旱、鹽脅迫下冀2658根部GhAOP2-like的表達量進行驗證,從圖3-B—F中看出,與對照相比,GhAOP2-like在干旱和鹽脅迫后表達量升高,這與蛋白質組測序結果一致。同樣,在3種激素處理后,GhAOP2-like表達量也呈現不同程度地上升趨勢,但在MeJA處理下表達量差異倍數最高,這可能是植物內不同激素間相互調控導致的。

3 結論與討論

AOP基因家族參與十字花科植物中脂肪族GSL的合成。不少研究發現,在環境脅迫下,植物中GSL的積累可參與滲透調節、提高水分吸收和運輸、增強植物的抗氧化能力[7]。因此,AOP基因對植物逆境下的生長發育具有非常重要的作用。

在擬南芥中,Kliebenstein等[7-8]鑒定出了AOP1、AOP2和AOP33個基因。其中AOP2能催化產生烯烴基硫苷。另外,Neal等[10]發現,AOP2至少以3個等位基因的形式存在于不同的擬南芥種質資源中,并證明其中一個等位基因AOP2-2在功能上能夠形成烯基形式硫苷。在甘藍和芥藍中,分別克隆了AOP2的同源基因BoGSL-ALK[9-10]和BoaAOP-like[12],它們都能催化產生脂肪族GSL。目前,關于AOP或AOP-like的功能研究主要集中于十字花科植物中,而且已發現的含有GSL的16個科中不包含錦葵科[16]。所以,陸地棉中AOP2-like可能像TM-1_v2.1_final.annotation中注釋的一樣參與其他萜類的合成。

研究發現,植物中GSL代謝應答模式根據脅迫的時間、強度、植物所處生長時期而具有多樣性[7]。Salehin等[17]在擬南芥中過表達AOP2可提高脂肪族GSL含量,并且GSL含量增加可能通過產生ROS促進氣孔關閉從而提高植物耐旱性。鹽脅迫下,脂肪族GSL可作為參與植物滲透調節作用的元素影響水平衡[18]。Martínez-Ballesta等[18]研究發現,脂肪族GSL可能與鹽脅迫下根系增殖有關,并且脂肪族GSL含量的變化可以影響擬南芥種子的萌發,改變水通道蛋白的豐度。但在高濃度鹽溶液下,GSL降解酶活性會提高,GSL的降解產物具有解毒的作用[19]。在芥藍中,Zheng等[12]克隆了一個BoaAOP-like基因,能夠調控脂肪族GSL的合成。BoaAOP-like定位于細胞質,與GhAOP2-like亞細胞定位預測結果一致。BoaAOP-like在根中表達量最高,并且在BoaAOP-like瞬時過度表達的植物中能夠提高AOP2.1的表達水平。在本研究前期測定的蛋白質組中,鹽脅迫下水通道蛋白豐度確實發生改變,其中9個上調,1個下調,但這是否與GhAOP2-like的調控有關還需進一步驗證。而在干旱脅迫下,只有1個水通道蛋白下調,說明GhAOP2-like調控干旱和鹽脅迫的機制不同。此外,GhAOP2-like在TM-1和海7124根部的高表達說明GhAOP2-like對根部的生長發育確實具有重要作用,可能調控脂肪族GSL類似物或萜類的合成,參與植物中滲透調節以維持水分平衡促進根系生長,并且在干旱脅迫下參與調節ROS的生成。

MYB家族是植物體內最大的一類轉錄因子,參與多種代謝途徑的調控[20]。其中MYB28、MYB29、MYB76正調控脂肪族GSL合成[21]。在甘藍中,BoAOP2的表達與BoMYB28、BoMYB29表達呈正相關[22]。擬南芥Col-0(擬南芥Col-0天然缺失AtAOP2基因)中過表達甘藍BoAOP2導致AtMYB28、AtMYB29的表達量和硫苷都有所增加。另外將BoAOP2在MYB28/29雙突變體中過表達,與對照相比,硫苷含量沒有明顯變化,說明BoAOP2過表達無法在雙突變體中實現硫苷積累[11]。此外,BoAOP2還可上調AtMYC2的表達[11]。研究表明,MYC2除了參與硫苷的合成,也是茉莉酸(Jasmonic acid,JA)信號通路的主要調控因子,MYC2參與JA調控的植物發育、側根和不定根形成[23],這可以解釋Martínez-Ballesta等[18]發現的脂肪族GSL與根系增殖相關。而且,MYC2也調節JA信號通路與其他植物激素(如脫落酸、水楊酸、赤霉素和生長素)之間的相互作用。由此可見,AOP2參與多個代謝網絡,可能在植物防御中起關鍵作用。本研究發現,GhAOP2-like的表達確實受到多種激素的調控,并且在MeJA處理下表達變化最強烈。所以,和AOP2一樣,GhAOP2-like也可能受到轉錄因子MYC2、MYB28、MYB29的調控,參與多種激素之間的協同作用,從而提高植物抗旱耐鹽的能力,但還需進一步論證。