宏病毒組測序檢測豆蚜田間種群病毒種類

樸 君,靳道然,,樸敬愛,季英華,孫 楓,李 碩

(1.遼寧師范大學 生命科學學院,遼寧 大連 116081;2.江蘇省農業科學院 植物保護研究所,江蘇 南京 210014)

蚜蟲屬于半翅目(Hemiptera)蚜總科(Aphidoidea),種類繁多,已知超過4 700種,繁殖快,適應能力強,主要分布在北半球的溫帶和亞熱帶地區[1]。蚜蟲的寄主范圍十分廣泛,寄主植物涉及267個科、2 120個屬,主要包括禾本科、豆科、蘭科、楊柳科等[2-3]。蚜蟲是農業主要害蟲之一,其為害主要包括直接為害和間接為害兩方面:直接為害是指蚜蟲借助口針刺吸植物嫩芽和新葉中的汁液來補充自身的營養物質,常導致植物生長緩慢;間接為害是指蚜蟲傳播植物病毒,蚜蟲在刺探和取食植物的過程,口針中結合的或唾液腺外泌的病毒粒子會被釋放進入植物體內[4],引起嚴重的植物病毒病害,致使農作物產量和品質降低,給農業生產造成嚴重的經濟損失。蚜蟲是最大的一類媒介昆蟲,其傳播的植物病毒超過蟲媒植物病毒種類的二分之一[3-4]。控制蚜蟲種群及其傳毒危害是保障農作物安全生產的有效手段。

病毒是一種具有細胞感染性的亞顯微粒子,個體微小,結構簡單,只能寄生在活細胞內并依賴宿主細胞因子以復制方式增殖[5]。自然界中幾乎所有的具有細胞結構的生命體都可以被病毒感染,病毒嚴重影響到了人類健康、社會安定以及地球生態系統的穩定[6]。在農業領域,對農業生產造成嚴重危害的同時,病毒也是重要的生物防治資源,其中昆蟲病毒殺蟲劑應用最廣,具有無污染、毒力高、防效長、靶標害蟲不易產生抗藥性等優點[7]。在我國,棉鈴蟲核型多角體病毒和松毛蟲質型多角體病毒是研究和應用較多的病毒,在害蟲生防中發揮了重要作用[8]。目前,已鑒定出涉及15個科600多種昆蟲致病性病毒[9]。蚜蟲具有聚集取食和轉主遷移習性,這為使用昆蟲病毒對其進行生物防治提供了有利條件。

豆蚜(Aphiscraccivora),也稱花生蚜,豆科作物重要害蟲,在長江流域年發生20代以上,豆蚜春季在蠶豆和紫云英上繁殖,5月中下旬以后,產生有翅蚜遷向刀豆、豇豆、花生等豆科植物上繁殖危害,11月以后遷向蠶豆、冬豌豆等心葉或葉背處繁殖越冬。目前,對豆蚜自然種群攜帶的植物和昆蟲病毒種類尚缺乏系統認識,為此,本研究通過宏病毒組測序對江蘇豆蚜田間種群所攜帶的病毒種類進行分析鑒定,不但可以掌握豆蚜傳播植物病毒的種類,利于植物病毒病防控,而且可以挖掘其體內昆蟲病毒資源、發現新病毒,為利用昆蟲病毒進行蚜蟲生防提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試蟲源:蚜蟲自然種群于2021年12月采自江蘇省南京市江寧區3塊蠶豆田,帶回實驗室后,根據相關文獻[10]進行形態鑒定,初步判定為豆蚜,蚜蟲置于-70 ℃保存。

主要試劑:TRIzol試劑購自Invitrogen公司;NEBNext Ultra Ⅱ RNA文庫制備試劑盒購自NEB公司;高保真DNA聚合酶、pMD18-T載體和反轉錄試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蚜蟲種類的分子鑒定 5頭蚜蟲為1組,設5組生物學重復,采用CTAB法提取蚜蟲總DNA。使用蚜蟲近緣種鑒定通用引物[11](LCO1490:5′-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,HCO2198:5′-TAAACTTCAGGCTGACCAAAAAATCA-3′)PCR擴增蚜蟲COI基因。分離純化擴增產物,連接至pMD18-T載體,經轉化大腸桿菌,選取陽性克隆測序。利用Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)比對測序結果,明確蚜蟲種類。

1.2.2 豆蚜總RNA的提取 鑒定蚜蟲種類后,取豆蚜500頭液氮研磨,使用TRIzol試劑提取總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA質量和完整性,NanoDrop 2000微量紫外分光光度計測定RNA純度(OD260/280及OD260/230比值),Qubit2.0 Fluorometer測定RNA濃度。

1.2.3 文庫構建和測序 RNA質控合格后,使用NEBNext Ultra Ⅱ RNA文庫制備試劑盒構建文庫。將總RNA除去核糖體RNA得到mRNA,隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將mRNA隨機打斷成短片段(250～300 bp),隨機引物將短片段反轉錄為第1鏈cDNA,PCR擴增cDNA,即得到測序文庫。文庫質檢合格后,進行Illumina測序,由測序公司完成。

1.2.4 數據處理與病毒注釋 過濾測序原始數據,去除帶接頭、含N(無法確定堿基信息)、低質量(Qphred≤20的堿基數占整個read長度50%以上)reads,得到高質量Clean reads,然后將其與蚜蟲基因組比對去除宿主的reads。獲得無宿主污染的數據后,使用Trinity軟件[12]進行轉錄本拼接,再利用DIAMOND軟件[13]將拼接結果與GenBank Virus RefSeq、NR和CDD數據庫比對,獲得候選序列。對病毒序列進行ORF預測、物種注釋、基因功能注釋,評估其有效性,鑒定出病毒種類。

1.2.5 新病毒分子檢測和序列分析 在豆蚜體內發現1種與細胞質彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)同源性較高的病毒,推測是一種新的植物病毒,對其進行基因檢測。根據Contigs序列,設計2對特異引物,Crhv1-F:5′-ATGAGGGGATTTACTGACCCGCCCT-3′,Crhv1-R:5′-CGGACACGCAATAGAGGGCCAT-3′,Crhv2-F:5′-GTTTTAGAAGAAATTCTTGCT-3′,Crhv2-R:5′-TTATAACATAACAAGGAAGAAC-3′。以蚜蟲總RNA為模板,利用反轉錄試劑盒合成第1鏈cDNA,進行PCR擴增。產物經基因克隆和測序,獲得病毒基因片段信息。使用Blast和DNAstar軟件MegAlign程序進行序列比對和同源性分析,利用MEGA-X軟件[14]采用最大似然法(Maximum Likelihood)完成氨基酸序列聚類分析,使用1 000次Bootstrap Replications驗證進化樹可信度。

此外,在豆蚜體內新發現了昆蟲病毒(HimetobiPvirus,HiPV),該病毒尚未在蚜蟲中報道,故對其進行核酸和蛋白檢測驗證。根據灰飛虱來源的HiPV結構蛋白VP1序列(GenBank登錄號:AB017037)設計引物,vp1-F:5′-GCTAACTTTGCGTCTACTG-3′和vp1-R:5′-CTAAACTTTGTCAAAGGGAT-3′,對VP1基因進行RT-PCR檢測和序列分析。同時,取30頭蚜蟲提取總蛋白,12.5%SDS-PAGE電泳后,使用實驗室前期制備的VP1抗體[15]進行Western Blot分析。

2 結果與分析

2.1 豆蚜的基因鑒定

田間采集的蚜蟲根據形態鑒定,初步判定為豆蚜。5頭蚜蟲分為1組,共5組,提取總DNA擴增COI片段,得到符合預期大小的特異條帶(圖1),測序顯示這些片段大小為707 bp且序列一致,經BlastN比對,其核苷酸序列與豆蚜COI基因片段(AB506718.1)相似性達99.58%,確定本研究所用蚜蟲為豆蚜。

M.DNA標準分子量;1—5.蚜蟲樣本。M.DNA Marker;1—5.Aphid samples.

2.2 宏病毒組測序獲得蚜蟲體內病毒序列信息

豆蚜文庫經宏病毒組測序得到35 867 014條原始序列,總堿基數為5.2 G,經質控后得到34 672 404條高質量的Clean reads,拼接后獲得127 863條Contigs。經GenBank、NR和CDD數據庫比對和分類注釋,篩選出病毒候選序列329條,ORF預測和基因注釋后,共獲得病毒序列177條,與24種病毒序列一致或同源性較高。

2.3 豆蚜體內病毒種類鑒定

鑒定的24種病毒中,有5種植物病毒,來自5個病毒科(表1),馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、帚狀病毒科(Virgaviridae)、泛歐爾密病毒科(Botourmiaviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)和白纖病毒科(Phenuiviridae),顯示測試的豆蚜群體攜帶該5個病毒科的病毒。其中匹配序列最多的病毒為一種與水稻條紋花葉病毒(Ricestripemosaicvirus,RSMV)有一定同源性的病毒,說明有一種彈狀病毒在豆蚜體內有較高的含量。鑒定了19種專性寄生的昆蟲病毒(表2),涉及9個病毒科,屬于DNA病毒的有桿狀病毒科(Baculoviridae)和昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae),屬于RNA病毒的有楚病毒科(Chuviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、雙順反子病毒科(Dicistroviridae)、復制酶置換四體病毒科(Permutotetraviridae)、Artoviridae、幻影病毒科(Phasmaviridae)以及呼腸孤病毒科(Reoviridae),此外,還包括6種暫未分類RNA病毒。這些昆蟲病毒,除黃病毒科和雙順反子病毒科病毒之前已在蚜蟲體內發現[16-17],其余在蚜蟲中鮮有報道。

表1 蚜蟲體內經宏病毒組測序鑒定的植物病毒Tab.1 Identified plant viruses in Aphis craccivora via virome sequencing

表2 蚜蟲體內經宏病毒組測序鑒定的昆蟲病毒Tab.2 Identified insect viruses in Aphis craccivora via virome sequencing

2.4 新植物彈狀病毒的檢測和序列分析

根據獲得的與RSMV同源的Contigs設計引物,對豆蚜總RNA進行RT-PCR檢測,檢出2個符合預期大小的條帶(圖2)。測序顯示,2個片段分別為558,460 bp,核苷酸序列經BlastN在NCBI數據庫中沒有比對到結果。氨基酸序列BlastX比對結果顯示,其與RSMV L蛋白(RNA聚合酶)(GenBank 登錄號:AZB50424.1)同源性最高,分別為51.61%,34.35%。另外,與該序列相似性較高的11種病毒分離物均來自細胞質彈狀病毒屬,2個片段與這11種彈狀病毒的L蛋白進行氨基酸序列比對,可以觀察到該序列與這些彈狀病毒具有相同的保守區(圖3)。這些結果說明,擴增的病毒基因片段來源于一種新的彈狀病毒,將其暫命名為Aphiscraccivoraassociatedrhabdovirus(AcARV)。將獲得的2個片段氨基酸序列合并,利用MEGA-X軟件將AcARV與上述11種彈狀病毒分離物進行系統進化分析,結果顯示,這些病毒L蛋白在系統進化樹中可聚類到2個大的分支中,AcARV與RSMV構成最小分支(圖4),說明這2種病毒在進化上最為近緣。在病毒聚類的兩大分支中,AcARV所在分支中含有9種病毒,其寄主主要為禾本科植物,暗示AcARV的植物寄主可能為禾本科作物。

A.病毒基因片段1的擴增;B.病毒基因片段2的擴增。A.PCR amplification of viral gene segment 1;B.PCR amplification of viral gene segment 2.

A.AcARV片段1與細胞質彈狀病毒的比對;B.AcARV片段2的比對;比對所涉及病毒序列信息:AcARV.本研究所獲序列;BARV.菜豆伴隨彈狀病毒(GenBank登錄號:QAU20941.1);BYSMV.大麥黃條點花葉病毒(YP_009177231.1);CARV.柑橘伴隨彈狀病毒(QMS92530.1);CBDAV.香芋波邦內病伴隨病毒(YP_009362280.1);MARV.玉米伴隨彈狀病毒(ARS22495.1);MSSV.玉米不育矮化病毒(QBJ27595.1);MYSV.玉米黃條紋病毒(ATN96453.1);NCMV.北方禾谷花葉病毒(NP_597914.1);PARV.番木瓜伴隨彈狀病毒(YP_010087157.1);RSMV.水稻條紋花葉病毒(AZB50424.1);RVR.玫瑰病毒R(QQZ02079.1)。A.Alignment among AcARV segment 1 and other Cytorhabdoviruses;B.Alignment of AcARV segment 2;Viral sequence information used in alignment is as follows:AcARV.Obtained in this study;BARV.Bean-associated rhabdovirus(GenBank No.QAU20941.1);BYSMV.Barley yellow striate mosaic virus(YP_009177231.1);CARV.Citrus-associated rhabdovirus(QMS92530.1);CBDAV.Colocasia bobone disease-associated virus (YP_009362280.1);MARV.Maize associated rhabdovirus(ARS22495.1);MSSV.Maize sterile stunt virus(QBJ27595.1);MYSV.Maize yellow striate virus(ATN96453.1);NCMV.Northern cereal mosaic virus(NP_597914.1);PARV.Papaya associated rhabdovirus(YP_010087157.1);RSMV.Rice stripe mosaic virus(AZB50424.1);RVR.Rose virus R(QQZ02079.1).

系統樹所用病毒序列信息與圖3一致。Viral sequence information used in phylogenetic tree is consistent with Fig.3.

2.5 豆蚜體內昆蟲病毒HiPV的檢測

為了檢測豆蚜體內昆蟲病毒HiPV的感染情況,根據HiPV灰飛虱分離物VP1基因設計引物,經RT-PCR擴增出目的片段(圖5-A),測序結果顯示,所擴條帶為774 bp的VP1基因。Blast比對顯示,其與日本灰飛虱分離物VP1序列(AB017037)核苷酸同源性為95.5%,氨基酸序列相似性為95.3%,與江蘇省農科院植保所病毒實驗室保存的灰飛虱群體中HiPV VP1相似度極高,核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.0%,98.1%,這說明不同昆蟲寄主之間HiPV的相似性很高。提取豆蚜總蛋白,經12.5% SDS-PAGE電泳后,用VP1抗體進行Western Blot檢測,結果顯示,可以從豆蚜中特異性檢測出一條約28 ku的蛋白條帶(圖5-B),符合預期大小,即為HiPV VP1蛋白,進一步從蛋白水平證明了豆蚜體內存在HiPV的感染,這是首次在蚜蟲體內發現HiPV。

A.HiPV VP1的PCR擴增;B.HiPV VP1的Western Blot檢測。A.PCR amplification of HiPV VP1 gene;B.Western Blot detection of HiPV VP1.

3 結論與討論

蚜蟲傳播病毒造成的危害已經極大程度超過了蚜蟲本身所帶來的危害[18]。目前,對蚜蟲的控制仍以化學防治為主,但大量使用殺蟲劑不僅污染環境,而且還會引起蚜蟲抗藥性,不符合農業綠色、可持續的發展趨勢。過去十多年,以天敵資源(主要是寄生蜂)為核心的蚜蟲生物防治也得到了長足的發展[19],而利用病原微生物控蚜的研究與應用仍然較少。昆蟲病毒是一種天然殺蟲劑,可以在宿主昆蟲種群中大規模傳播,具有殺蟲毒力高、環境污染小等優點,且不易誘導昆蟲產生抗性[7]。我國在20世紀60年代初開始將昆蟲病毒用于生物防治,目前,已有30多種昆蟲病毒被用于農林害蟲防治[20]。當前,人們仍掌握不清蚜蟲群體中昆蟲病毒種類,制約了利用病毒進行蚜蟲生防的研究工作。為此,本研究通過宏病毒組測序對江蘇豆蚜種群所攜帶的病毒種類進行了分析鑒定,以期在掌握其攜帶植物病毒的同時,挖掘其體內昆蟲病毒資源。

宏病毒組,又稱病毒轉錄組,是一種新興的以宏轉錄組為理論基礎的病毒分子檢測技術,可直接以組織或環境樣本為對象,快速鑒定樣本中全部病毒種類,為病毒病快速診斷、新病毒發現和病毒流行預警提供了有力支撐。與傳統病毒檢測技術相比,高通量測序技術(主要包括宏病毒組和小RNA深度測序)極大提高了病毒檢測的效率和準確性,具有無法比擬的優勢。隨著該技術不斷成熟和成本降低,其已成為臨床和實驗室研究中的常用技術,利用該技術鑒定的新病毒種類日趨增多[21-22]。作者之前在半翅目昆蟲中首次發現類復制酶置換四體病毒,便是基于高通量測序技術完成鑒定[23]。

本研究對豆蚜攜帶的病毒種類進行了全面分析,共鑒定出24種病毒,其中植物病毒5種,昆蟲病毒19種。對植物病毒中Contigs數目最多的病毒進行基因檢測和序列分析,發現其與RSMV的RNA聚合酶氨基酸序列同源性最高(51.61%),且與其他細胞質彈狀病毒屬成員具有共同的保守區,這提示在豆蚜體內檢測到一種新的彈狀病毒,暫命名為AcARV。細胞質彈狀病毒屬病毒的分布是世界性的,單個病毒的寄主范圍較窄,但整個屬的寄主范圍較廣。該屬成員可由蚜蟲、葉蟬、飛虱等媒介昆蟲傳播,病毒在植物和介體昆蟲體內均可增殖,少數病毒也可經汁液傳播。前期有研究在煙粉虱體內也鑒定出類似的彈狀病毒(Bemisiatabaciassociatedvirus1)[24]。本研究發現的AcARV由蚜蟲傳播,但其植物寄主尚不清楚,根據目前掌握的氨基酸序列系統進化分析結果,AcARV與其他8種病毒聚類成一個大的分支,該分支中的成員其寄主要為禾本科植物,推測AcARV的寄主可能是禾本科作物。由于豆蚜主要取食危害豆科植物,因此,也不排除AcARV的植物寄主為豆科作物。當然,其真實寄主的確定還需后續對相關植物進行病毒病害調查和檢測鑒定。另外,AcARV全基因組序列尚不清楚,也需進一步完成測序。

在鑒定的昆蟲病毒中,HiPV較為引人注意。HiPV為雙順反子病毒科Triatovirus屬成員(原為蟋蟀麻痹病毒屬Cripavirus成員),是一種低致病性、可持續性感染宿主的病毒[25]。該病毒最早由日本學者在灰飛虱中發現,之前報道的HiPV寄主僅為幾種稻飛虱[25],本研究證明了豆蚜體內存在HiPV的感染,這是首次在蚜蟲體內發現HiPV,該病毒能否侵染其他蚜蟲種類有待進一步明確。作為正單鏈RNA病毒,HiPV基因組結構簡單[26],通過侵染性克隆“拯救”策略大量制備該病毒相對較為容易,昆蟲寄主范圍的擴大使其具備作為生防病毒的潛力。HiPV對稻飛虱的致病性較弱,是其用作生防病毒的不足之處,對其毒力基因進行改造增加致病力,將是決定其生防應用前景的關鍵。同為雙順反子病毒科的Rhopalosiphumpadivirus(RhPV)可感染蚜蟲,并縮短其壽命和抑制繁殖力[17],HiPV對蚜蟲的致病性程度決定著其在防治蚜蟲方面的應用潛力,后續值得關注。病毒與昆蟲在長期進化過程中形成了復雜多樣的關系。多數昆蟲病毒對寄主產生致病性不利于其生存,而少數病毒則有利于寄主昆蟲的生存和擴散[27]。前期研究發現,HiPV可與灰飛虱傳播的水稻條紋病毒互作并參與調控病毒增殖[28],蚜蟲作為重要的媒介昆蟲,HiPV在其體內是否影響蚜蟲對植物病毒的傳播,這也是一個令人感興趣且有意義的研究方向。此外,還在蚜蟲體內發現了復制酶置換四體病毒科病毒,之前本實驗室在灰飛虱中也發現了這類病毒[23],這說明自然界中該類病毒在昆蟲體內廣泛存在。

本研究鑒定了江蘇地區越冬豆蚜群體中攜帶的病毒種類,結果發現,蚜蟲體內含有多種植物病毒,說明其對周邊農作物有潛在的傳毒威脅,因此,生產上需要加強對蚜蟲傳播病毒病的監測和防控。同時,發現豆蚜體內昆蟲病毒資源較為豐富,證實HiPV可感染蚜蟲,為今后生防研究和應用提供了候選病毒資源。