可注射性富血小板纖維蛋白混合軟骨顆粒制備支撐移植物實驗研究

馬澤坤, 侯團(tuán)結(jié), 陳 嘯, 李平松

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225009;2. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 燒傷整形科-醫(yī)學(xué)美容科, 江蘇 揚州, 225009)

鼻整形手術(shù)能夠明顯改善面部輪廓和增強面部立體感,已成為整形手術(shù)中極為常見的項目之一。人工材料作為鼻整形手術(shù)主要的支撐移植物,可引起不同程度的排異反應(yīng)、感染、移位,甚至發(fā)生假體外露等情況。1941年經(jīng)YOUNG F[1]首次報道后,顆粒軟骨被廣泛應(yīng)用于鼻整形手術(shù)中[2-6]。但是單純的軟骨顆粒移植存在吸收率高、生存能力差問題,且由于缺乏固定,散在的軟骨顆粒在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、外觀流暢性等方面有所欠缺,嚴(yán)重影響了手術(shù)效果。可注射性富血小板纖維蛋白(i-PRF)作為新一代血小板濃縮物,在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化方面效果確切,對術(shù)后炎癥過程具有積極影響[7]。此外,作為一種液-固形態(tài)轉(zhuǎn)換的血小板濃縮物, i-PRF混合軟骨后能減小軟骨顆粒的移動度,使其在支撐物中的位置更為固定。本研究將高密度多孔聚乙烯(HPDE)材料作為提供支撐力的移植物基底,用混合i-PRF的軟骨顆粒覆蓋HPDE材料形成軟骨支撐移植物在動物皮下進(jìn)行體內(nèi)實驗,以期減少材料直接接觸皮膚組織所致排異、外露等情況,并與單純軟骨顆粒覆蓋人工材料所得移植物的效果進(jìn)行比較,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級成年新西蘭白兔9只,平均體質(zhì)量2.5 kg, 均由南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場提供,許可證號SCXK(蘇)2019-0005。實驗過程中對動物的處置措施均符合2006年國家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 實驗材料與儀器

HPDE材料舒鉑(Su-por, 型號4008, 厚度0.85 mm, 規(guī)格3.8 cm×5.0 cm), 購自美國Poriferous公司; SA1020-小鼠/兔IgG SABC免疫組化染色試劑盒(博士德公司); 兔Ⅱ型膠原多克隆抗體(Proteintech, 美國); DAB顯色試劑盒(博士德公司); 免疫熒光染色試劑盒-抗兔AF594(伊萊瑞特公司); CD31抗體(Affinity, 美國); 改良Masson三色染色試劑盒(索萊寶公司); 改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒(索萊寶公司); 掃描電子顯微鏡(HITACHI, 日本); 倒置相差顯微鏡(ZEISS, 德國)。

1.3 實驗方法

i-PRF制備: 分別在無菌條件下對白兔進(jìn)行心臟取血10 mL至不含抗凝劑的真空負(fù)壓管中,立即于離心機中以700轉(zhuǎn)/min離心3 min, 全血分為2層,上層黃色清亮液體即i-PRF, 取出備用。

軟骨顆粒制備: 分別在無菌條件下取白兔耳軟骨,剝離下表皮及皮下纖維軟組織,露出光滑軟骨,先后置于含2%雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)和不含雙抗的PBS中清洗3～5 min, 用無菌手術(shù)刀將軟骨切割成1～2 mm3顆粒備用。對白兔耳部創(chuàng)緣進(jìn)行清洗消毒,并加壓包扎。

人工材料準(zhǔn)備: 將HPDE材料修剪為邊長1.5 cm的方形材料備用。

支撐移植物制備: 將支撐移植物分為4組,即A組(單純HPDE材料組,n=9)、B組(i-PRF+HPDE材料組,n=9)、C組(軟骨顆粒+HPDE材料組,n=9)和D組(i-PRF+軟骨顆粒+HPDE材料組,n=9)。A組僅HPDE材料, B組是將1 mL i-PRF直接均勻覆蓋于HPDE材料上, C組是將相同大小的20塊軟骨顆粒直接平鋪于HPDE材料上, D組是將1 mL i-PRF與20塊軟骨顆粒混合后再均勻鋪于HPDE材料上,i-PRF約15 min凝固,呈膠狀混合軟骨顆粒。4組移植物所用HPDE材料的大小、形狀均一致,邊長約為1.5 cm。

動物體內(nèi)實驗: 以3%戊巴比妥(30 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉,將白兔伸膝位俯臥固定,備皮消毒,手術(shù)區(qū)域鋪巾。將每只白兔取背部上下左右共4個位置分別做長約1.5 cm的橫行切口,用眼科剪鈍性分離皮下組積,再將4組各1個移植物埋入對應(yīng)白兔已分離好的皮下組織中。用生埋鹽水清洗后縫合手術(shù)切口,完成體內(nèi)實驗,術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

組織切片獲取: 將9只實驗白兔按隨機數(shù)字表法分為3個觀察批次(每個批次3只),分別于術(shù)后4、8、12周時取出各組移植物。

組織學(xué)觀察方法: ① 肉眼觀察,取出4組移植物后進(jìn)行肉眼觀察,觀察各組移植物表面組織生長被覆情況。② 電鏡觀察,將獲得的D組移植物固定至2.5%戊二醛固定液4 ℃過夜后于電鏡下觀察,觀察人工材料內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)和軟骨顆粒、組織在材料中長入情況。③ 蘇木素-伊紅(HE)染色法,將切片常規(guī)脫蠟至水,以蘇木素浸染3～5 min, 分化液中分化2～3 s, 反藍(lán)液中反藍(lán)5～10 s, 85%乙醇脫水,伊紅浸染,最后脫水,透明,封片,于光鏡下觀察各組人工材料上被覆組織(軟骨顆粒、纖維組織等)的生長情況。④ 番紅O-固綠染色法,按照改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒說明書流程進(jìn)行操作,對C組和D組中的軟骨顆粒進(jìn)行特異性染色,觀察其生長情況。由于A組和B組中不含軟骨顆粒,該染色法中未納入A組和B組。⑤ Ⅱ型膠原免疫組化法,按照SA1020-小鼠/兔IgG SABC免疫組化染色試劑盒說明書流程進(jìn)行操作,對C組和D組軟骨中的Ⅱ型膠原進(jìn)行染色,觀察軟骨顆粒的生長情況。由于A組和B組中不含軟骨顆粒,該染色法中未納入A組和B組。⑥ Masson染色法,按照改良Masson三色染色試劑盒說明書流程進(jìn)行操作,對A組和B組中的膠原纖維進(jìn)行染色,觀察其長入人工材料的情況。由于C組和D組中有軟骨顆粒,會影響對其空隙中膠原纖維的染色及觀察,該染色法中未納入C組和D組。⑦ CD31免疫熒光法,按照免疫熒光染色試劑盒-抗兔AF594說明書流程進(jìn)行操作,對A組和B組中的血管內(nèi)皮進(jìn)行染色,觀察新生血管長入人工材料的情況。由于C組和D組中有軟骨顆粒,會影響對其空隙中新生血管的染色及觀察,該染色法中未納入C組和D組。

2 結(jié) 果

2.1 移植物肉眼觀察結(jié)果

術(shù)后12周時,取出各組移植物后進(jìn)行肉眼觀察。觀察結(jié)果顯示, 4組移植物表面均有纖維血管包被,說明組織能夠包繞移植物進(jìn)行生長; 相較于A組,B組材料表面的纖維血管在肉眼觀察下更明顯; 相較于C組, D組移植物從皮下取出后軟骨顆粒丟失較少,較為穩(wěn)定地固定于材料上,且表面纖維血管更豐富; C組軟骨顆粒部分缺失,皮下包埋過程中移動損失較多,表面組織血管較D組匱乏。見圖1。

A: A組移植物典型圖; B: B組移植物典型圖; C: C組移植物典型圖; D: D組移植物典型圖。

2.2 電鏡觀察結(jié)果

電鏡掃描結(jié)果顯示,該HPDE材料為疏松多孔結(jié)構(gòu),孔隙之間相互貫通,見圖2A。術(shù)后4周時D組移植物電鏡掃描結(jié)果顯示,纖維血管等軟組織包裹著HPDE材料及附著其上的軟骨顆粒,且支撐移植物的孔隙中有纖維血管長入,見圖2B、圖2C。

A: 新型HPDE材料電鏡掃描圖; B: 術(shù)后4周時D組移植物電鏡縱向掃描圖(典型圖);C: 術(shù)后4周時D組移植物電鏡橫向掃描圖(典型圖)。

2.3 HE染色法觀察結(jié)果

術(shù)后4周時, C組軟骨顆粒的邊緣有再生趨勢,有橫形排列的梭形的成軟骨細(xì)胞及新生軟骨細(xì)胞,軟骨顆粒之間界限清晰,切緣平整; D組軟骨顆粒邊緣部分新生軟骨細(xì)胞已增殖形成同源細(xì)胞群,向軟骨外附加性生長,軟骨顆粒邊緣較平整,較少數(shù)切緣由于局部軟骨細(xì)胞增殖較快而形成凸起。術(shù)后8周時, C組部分細(xì)胞處于成熟期,靠近顆粒尖端處細(xì)胞增殖較明顯,呈現(xiàn)互相連接的趨勢,大部分顆粒切緣清晰,但存在多處細(xì)胞增殖形成的凸起; D組較多軟骨細(xì)胞處于成熟期,大部分邊緣的細(xì)胞以及部分處于顆粒內(nèi)部的軟骨細(xì)胞增殖形成同源細(xì)胞群,部分軟骨顆粒之間已被增殖的軟骨細(xì)胞填充連接,切緣由于軟骨細(xì)胞生長而失去平整性。術(shù)后12周時,C組軟骨顆粒同時存在邊緣的附加性生長和內(nèi)部的間質(zhì)性生長,部分顆粒切緣由于軟骨增殖及與相鄰軟骨連接而已消失; D組軟骨顆粒之間基本相互連接,邊界消失,提示含有i-PRF的移植物軟骨顆粒之間能更快連接成片。B組和A組HPDE材料孔徑內(nèi)均有纖維血管長入,且2組術(shù)后12周時組織長入明顯比術(shù)后4周時豐富,但A組術(shù)后4、8、12周時組織量均比同時期B組少,長勢不如B組。見圖3。

A、B、C: A組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖; D、E、F: B組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖;

2.4 番紅O-固綠染色法觀察結(jié)果

術(shù)后4周時, C組邊界較清晰平整,邊緣處未被番紅O著色, D組的部分軟骨顆粒邊緣有橫行的紅色淡染區(qū),與HE染色中新生軟骨細(xì)胞情況一致,說明有新生軟骨細(xì)胞向邊緣長出。術(shù)后8周時, C組的部分軟骨顆粒連接處同樣有番紅O著色,但染色較淡, D組的部分軟骨顆粒連接處為紅色,已被新生的軟骨細(xì)胞填充。術(shù)后12周時,C組多數(shù)軟骨顆粒之間已被番紅O染色,但部分顆粒邊界尚清, D組番紅O染色幾乎連接成片,顆粒染色邊界不清晰。見圖4。

A、B、C: C組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖; D、E、F: D組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖。

2.5 Ⅱ型膠原免疫組化法觀察結(jié)果

Ⅱ型膠原分布情況顯示, C組的軟骨顆粒在術(shù)后4周時邊界較清楚,術(shù)后12周時銜接變緊密,但效果不如D組; 隨著時間的推移, D組軟骨顆粒之間銜接變緊密,術(shù)后12周時基本連接成片。見圖5。

A、B、C: C組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖; D、E、F: D組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖。

2.6 Masson染色法觀察結(jié)果

術(shù)后4周時, A組有少量膠原纖維長入材料孔隙內(nèi),B組則多于A組; 術(shù)后8周時,A組材料孔隙內(nèi)膠原纖維含量增加, B組膠原纖維含量亦增加,且總體含量多于A組; 術(shù)后12周時, A組與B組的膠原纖維含量均增加,且B組膠原纖維含量高于A組。見圖6。

A、B、C: A組術(shù)后4、8、12周的光鏡下典型圖; D、E、F: B組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖。

2.7 CD31免疫熒光法觀察結(jié)果

術(shù)后4周時, B組和A組材料孔隙內(nèi)均有新生血管形成,但血管密度較低; 術(shù)后8周時, B組和A組血管密度均升高; 術(shù)后12周時, B組和A組血管密度均更高; B組不同時點的新生血管密度均高于A組,即B組新生血管長勢更快。見圖7。

A、B、C: A組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖; D、E、F: B組術(shù)后4、8、12周時的光鏡下典型圖。

3 討 論

本研究探討了i-PRF混合軟骨顆粒覆蓋HPDE制備復(fù)合軟骨支撐移植物的方法,結(jié)果顯示, i-PRF混合軟骨顆粒覆蓋于新型HPDE材料所形成的復(fù)合軟骨支撐移植物的細(xì)胞增殖及血管化能力較強,同時軟骨顆粒固定較好,更符合臨床需求,可為臨床手術(shù)治療提供新的選擇。本研究不僅分析了i-PRF的加入對移植物中軟骨顆粒的影響,還分析了i-PRF的加入對移植物中纖維和血管包裹與長入人工材料的影響,由于顆粒軟骨的存在會一定程度上影響對纖維和血管組織學(xué)形態(tài)的觀察,本研究另行設(shè)立無軟骨顆粒的單純HPDE材料組(A組)和i-PRF+HPDE材料組(B組),以便更直觀地觀察組織形態(tài)。

本研究中, D組以新型HPDE材料舒鉑為支架并鋪墊為基底,將顆粒軟骨與i-PRF混合后覆蓋其表面,能有效減少人工材料與軟組織直接接觸而引起的并發(fā)癥。人工材料從最初的硅膠到膨體再到Medpor、新型HPDE材料等,性能已不斷改進(jìn)[8-13]。但即便如此,作為非自體物質(zhì),這些材料被植入人體組織后,仍可能引發(fā)感染、變形、排異甚至材料外露等風(fēng)險[11, 14]。舒鉑是由HPDE材料高溫高壓壓合制成的生物材料,有足夠的硬度輔助構(gòu)建鼻下端力學(xué)結(jié)構(gòu),能為移植物提供良好的力學(xué)支撐[15], 其內(nèi)部為疏松多孔結(jié)構(gòu),孔徑約200 μm且孔隙率占整體材料的50%,更適應(yīng)人體組織的良好血管化生長,易重建血液循環(huán),增加生物相容性。將i-PRF與軟骨顆粒混合后覆蓋于HPDE材料表面,液-固態(tài)轉(zhuǎn)換的i-PRF可對軟骨顆粒起到位置固定作用,使其更好地黏附于材料上,避免手術(shù)操作中軟骨顆粒的大量脫落。更重要的是,單純的軟骨顆粒還存在自行吸收和移位的弊端,故EROL O O[16]曾針對性提出經(jīng)典的“Trukish”理論,即土耳其軟糖模型,而DANIEL R K等[17]曾提出使用筋膜組織包裹軟骨顆粒以減少吸收。但有研究[18]發(fā)現(xiàn),比起單純的散在軟骨顆粒,有Trukish或筋膜包裹的軟骨顆粒由于覆蓋物在軟骨與受體組織之間形成屏障,損害了血漿向軟骨的擴散能力而使得軟骨顆粒生存能力下降。i-PRF則可減少軟骨顆粒的吸收,并促進(jìn)軟骨顆粒連接成片,形成一層較為完整的軟骨組織。

本研究結(jié)果顯示,含有i-PRF的復(fù)合軟骨支撐移植物中,軟骨顆粒生長較快,能更快連接成片; 含有i-PRF的移植物膠原纖維和新生血管能夠更多地覆蓋材料表面及長入材料空隙中,為軟骨顆粒提供了良好的生長環(huán)境,從而更快地建立血液循環(huán)。同時,由于初期i-PRF的混合,移植物中軟骨顆粒更為穩(wěn)定,減少了散在軟骨顆粒的移動,可保持移植物的完整性。i-PRF是繼富血小板血漿(PRP)、富血小板纖維蛋白(PRF)后的第3代血小板濃縮物[19],其纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)更加緊密,電鏡下可觀察到活化的細(xì)胞嵌入i-PRF緊密的三維纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中[20], 相較其他血小板濃縮物,低速離心形成的i-PRF中白細(xì)胞、血小板及生長因子含量更高,分布更均勻,這些成分的結(jié)合在組織再生中起著重要作用。在體外培養(yǎng)實驗中, i-PRF通過上調(diào)S0X9、COL2A1、ACAN等軟骨形成相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖與分化,一系列體內(nèi)實驗顯示i-PRF能夠促進(jìn)軟骨缺損部位軟骨組織再生及與周圍健康組織的融合。GODE S等[21]通過鼻整形手術(shù)臨床試驗驗證,i-PRF能夠降低軟骨顆粒的吸收率。另有研究[22-23]發(fā)現(xiàn), i-PRF能夠更多地釋放表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等生長因子以及Ⅰ型膠原蛋白(Col-1), 這些因子有效促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖與分化。ZHANG J L等[24]已證實,i-PRF在組織愈合過程中具有潛在的抗炎作用,能夠顯著削弱巨噬細(xì)胞的促炎作用,激活和趨化感染區(qū)域周圍的樹突狀細(xì)胞。JASMINE S等[25]也提出,i-PRF對細(xì)菌及其生物膜均具有明顯殺菌活性,在預(yù)防術(shù)后葡萄球菌感染方面具有應(yīng)用潛能。這些潛在的抗炎殺菌作用在減少移植手術(shù)術(shù)后感染、促進(jìn)軟骨及纖維血管生長的同時,可為移植物提供較為適宜的微環(huán)境,減少感染、炎癥等導(dǎo)致的皮膚破潰、移植物暴露等情況發(fā)生。

本研究結(jié)果提示了i-PRF-軟骨顆粒-人工材料復(fù)合軟骨支撐移植物的應(yīng)用可能性,為臨床鼻整形手術(shù)的開展提供了新的思路。但本研究仍存在不足之處: ① 研究處于動物實驗階段,尚未進(jìn)行臨床試驗,故未能獲得可信的臨床資料; ② 將移植物埋于皮下軟組織中,與鼻整形手術(shù)中埋于骨組織附近有所不同,尚不明確能否完全模擬鼻部皮下環(huán)境; ③ 同樣情況下,體積偏小的軟骨顆粒存活能力和再生能力更強(資料[26]顯示,邊長0.5～1.5 mm的軟骨顆粒存活能力和穩(wěn)定性隨著邊長的增加而增強),但最適形狀和體積仍需進(jìn)一步探索; ④本研究的最長觀察期為術(shù)后12周,更為長期的軟骨生存吸收情況、軟骨增殖及骨化情況目前尚未可知,且后期i-PRF對移植物是否有過度血管化情況亦不明確。未來,研究者需針對這些問題進(jìn)一步深入研究,從而對本研究結(jié)論加以驗證。