DnaJ熱休克蛋白家族成員C9在肺腺癌中的表達及預后價值

王 愿, 李江濤, 姬巧霞, 張 煥, 才虹美, 李義帥

(河北省胸科醫院/河北省肺病重點實驗室, 1. 腫瘤二科, 2. 呼吸三科, 3. 結核三科,4. 胸外三科, 河北 石家莊, 050000)

非小細胞肺癌發生率約占肺癌總發生率的85%[1]。肺腺癌(LUAD)是最常見的組織學亞型,早期易發生血行轉移。目前,雖然靶向治療和免疫治療廣泛應用于臨床,取得了重大進展,但晚期疾病表現、轉移、治療抗性、5年生存率仍不理想。因此,迫切需要開發全新和更持久有效的LUAD治療方法和新的生物標志物。熱休克蛋白(HSPs)家族是機體受各種應激原刺激后產生的一組應激蛋白,又稱熱應激蛋白,可參與細胞內蛋白質折疊、轉運和免疫、凋亡等多個生理功能,在多數腫瘤細胞中表達增高,并參與腫瘤的生長[2]、侵襲、轉移[3]、免疫浸潤[4]等。DnaJ熱休克蛋白家族成員C9(DNAJC9)是HSPs家族中的一員,在細胞增殖、凋亡、分化和免疫應答等方面有重要作用,但其在LUAD發生、發展中的作用尚無相關研究。本研究系統分析DNAJC9在LUAD中的表達及預后價值,可能為LUAD診斷、治療及預后提供新的靶點或生物標志物。

1 材料與方法

1.1 數據來源及整理

本研究中基因表達數據和臨床信息來源于TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-gnomics/tcga), 提取535例LUAD和59例鄰近腫瘤的正常組織RNAseq測序數據,并結合基因型-組織表達 (GTEx)數據庫中正常肺組織樣本的數據,增加對照樣本的數量。收集臨床病理參數,包括年齡、性別、種族、病理分期、TP53突變。利用survival包、pROC包進行生存資料及臨床診斷的分析,并用survminer包及ggplot2包進行可視化分析。

1.2 組織標本免疫組化檢測

采用免疫組化檢測2020年1月—2022年12月河北省胸科醫院40例LUAD石蠟包埋的腫瘤標本中DNAJC9蛋白的表達。本研究通過醫院倫理委員會批準(批號2021052)。主要試劑: SP-9000試劑盒和DAB(ZLI-9018)試劑均購自中山金橋生物公司, DNAJC9兔單克隆抗體(EPR9856)(濃度1∶200)購自博士德生物公司,蘇木素染料購自北京雷根生物公司。免疫組化檢測DNAJC9蛋白的表達: 采用甲醛固定新鮮的LUAD及癌旁組織,石蠟包埋,切片、烤片、脫蠟、抗原修復、滲透、封閉等操作,給予一抗(DNAJC9 抗體1∶200)過夜,加入二抗及辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,采用DAB染色,蘇木素復染,脫水封片[5]。結果判定: 棕黃色為DNAJC9蛋白陽性染色。染色強度: 無著色計為0分,淡棕色計1分,深棕色計2分; 染色細胞百分比: <5%計0分, 5%～25%計1分, >25%～50%計2分, >50%計3分。2項得分相加為總分,將總分≥2分設為高表達,反之為低表達。由2名病理科醫師判定結果。

1.3 DNAJC9與LUAD腫瘤浸潤性免疫細胞(TIICs)的關系

通過TIMER數據庫 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中的Gene模塊分析LUAD中DNAJC9表達及其與免疫細胞浸潤水平的相關性。TIMER數據庫中分析的免疫細胞包括B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。本研究使用單樣本基因集富集分析(ssGSEA)分析了24種腫瘤浸潤免疫細胞(TIICs)的免疫反應,以評估LUAD中DNAJC9表達與免疫細胞浸潤的相關性。

1.4 DNAJC9和其他基因表達的相關性分析

通過GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析在LUAD中DNAJC9與免疫檢查點基因表達的相關性。

1.5 DNAJC9甲基化分析

利用UALCAN數據庫(http://UALCAN.path.uab.edu/)分析DNAJC9在LUAD中的表達及其與臨床基本特征的關系。同時本研究利用UALCAN數據庫中的Methylation甲基化分析了DNAJC9在腫瘤樣本、腫瘤分期、淋巴結轉移等各個亞組中的甲基化水平。利用TCGA Wanderer數據庫(http://maplab.imppc.org/wanderer/index.html)分析DNAJC9與LUAD發生、發展相關的甲基化位點。

1.6 DNAJC9相互作用蛋白及通路富集分析

String數據庫(https://string-db.org/)是由已知蛋白和預測蛋白分子之間相互作用的數據組成,包括直接和間接相互作用數據。本研究通過使用String數據庫分析DNAJC9蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI),在數據庫中輸入"DNAJC9", 物種類型選擇"Homosapiens", 置信度選擇"Medium 0.400", 相互作用最大數選擇10。利用FUNRICH軟件對DNAJC9相互作用蛋白進行功能富集分析。

1.7 統計學分析

采用R軟件(version.3.6.3; http://www.Rproject.org)對所有統計數據進行分析。采用Wilcoxon秩和檢驗和Logistic回歸分析探討DNAJC9與臨床病理學參數的關系。采用DNAJC9表達評分進行單變量和多變量回歸分析。采用Kaplan-Meier法構建生存曲線,差異采用Log-rank檢驗,并且使用單因素Cox比例風險回歸分析估計操作系統的個體風險比(HR)。將單因素分析中P<0.05的因素納入多因素Cox分析。測量HR和95%置信區間(CI)以估計單個因素的HR。采用Spearman相關性分析探討基因之間的關系。所有結果的P值均為雙側,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 生物信息數據庫分析LUAD中DNAJC9的表達

TIMER數據庫分析結果顯示, DNAJC9在膀胱癌、乳腺癌、膽管癌、結直腸癌、食管癌、肝癌、肺鱗癌、LUAD、胃癌、甲狀腺癌等大部分實體腫瘤中均呈高表達; TCGA數據庫分析結果顯示,非配對及配對組織中, DNAJC9在LUAD組織中的表達高于癌旁正常肺組織,差異有統計學意義(P<0.01), 見圖1。

A: TIMER數據庫中DNAJC9在泛癌中的表達; B: TCGA數據庫中DNAJC9在LUAD與非配對組織中的表達;C: TCGA數據庫中DNAJC9在LUAD與配對正常組織中的表達; D: TCGA結合GTEx數據庫正常組織和LUAD組織中DNAJC9的表達。兩者比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.2 LUAD組織中DNAJC9的表達情況

DNAJC9在細胞質或細胞核中均有表達, DNAJC9蛋白在癌組織的表達率為80.0%(32/40), 高于癌旁組織的45.0%(18/40), 差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2。

A: DNAJC9蛋白在LUAD組織中的表達; B: DNAJC9蛋白在對應癌旁組織中的表達。

2.3 DNAJC9在LUAD中的預后分析

DNAJC9在LUAD的預后分析結果顯示,高表達患者總生存率、無疾病生存率和無進展生存率表達降低,差異有統計學意義(P<0.05), 提示DNAJC9高表達患者預后更差。受試者工作特征(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)為0.889, 見圖3, 表明DNAJC9在LUAD中的診斷價值較高。

A: 總生存期; B: 疾病特異性生存期; C: 無疾病進展生存期; D: ROC曲線。

2.4 DNAJC9表達與LUAD臨床病理特征的關系

LUAD組織中, DNAJC9的表達高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.01); 與TP53未突變LUAD組織相比, TP53突變LUAD組織DNAJC9的表達升高,差異有統計學意義(P<0.01); 基于患者性別、種族、分期以及有無淋巴結轉移等的亞組分析中,與正常組織相比, LUAD組織中DNAJC9的表達增高,見圖4。

2.5 DNAJC9啟動子甲基化水平與LUAD患者臨床特征的關系

UALCAN數據庫分析發現,LUAD組織較正常組織DNAJC9啟動子甲基化水平較低; 在腫瘤分期中, 1、2、3、4期組織較正常組織的DNAJC9啟動子甲基化水平降低; 淋巴結轉移患者較正常組織DNAJC9啟動子甲基化水平降低,見圖5A～5C。TCGA Wanderer分析結果發現, DNAJC9與LUAD發生發展相關的甲基化位點有9個,分別是cg04197548、cg07061913、cg07959124、cg05313302、cg19838697、cg109519462、cg20441175、cg07982481、cg04745336, 均維持低甲基化修飾水平,見圖5D。

A: DANJC9的甲基化狀態在正常組織和LUAD的分布情況; B: DANJC9的甲基化狀態在LUAD不同分期的分布情況; C: DANJC9的甲基化狀態在LUAD不同淋巴結轉移分期的分布情況; D: TCGA Wanderer數據庫分析DNAJC9在LUAD中有意義的低甲基化位點。

2.6 DNAJC9表達與腫瘤免疫細胞浸潤的關系

DNAJC9表達與B細胞(r=0.157,P<0.01)和中性粒細胞 (r=0.102,P<0.05)的浸潤水平呈正相關。DNAJC9的高表達與T細胞、DC細胞、NK CD56dim細胞、巨噬細胞、Mast細胞、CD8 T細胞、B細胞、T輔助細胞、調節性T細胞、Th17細胞和Th2細胞具有顯著相關性(P<0.05), 見圖6。

A: DNAJC9表達水平與腫瘤免疫細胞浸潤的相關性; B: DNAJC9高表達、低表達細胞中24種免疫細胞亞型富集分析。兩者比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.7 DNAJC9在LUAD中的表達與免疫檢查點的關系

通過GEPIA數據庫分析DNAJC9表達與LUAD中常見免疫檢查點基因表達水平的相關性。DNAJC9基因與CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3這4個免疫檢查點基因的表達呈正相關,差異有統計學意義(r=0.11,P<0.05;r=0.11,P<0.05;r=0.27,P<0.01;r=0.12,P<0.05),見圖7。

A: GEPIA數據庫中DNAJC9與CTLA4表達的關系; B: GEPIA數據庫中DNAJC9與PDCD1表達的關系;C: GEPIA數據庫中DNAJC9與CD274表達的關系; D: GEPIA數據庫中DNAJC9與LAG3表達的關系。

2.8 DNAJC9蛋白相互作用網絡及功能富集分析

String數據庫中分析得到具有11個節點的DNAJC9蛋白互作網絡,包括微小染色體維持復合物成分6(MCM6)、核糖核苷酸還原酶催化亞基M1(RRM1)、核自身抗原精子蛋白(NASP)、皮瓣結構特異性內切酶(FEN1)、脫氧尿苷三磷酸酶(DUT)、復制因子C亞基4(RFC4)、序列相似的家族149成員B1 (FAM149B1)、MutS同源2(MSH2)、染色體的結構維持2(SMC2)、小染色體維持復合體成分2(MCM2)(score>0.900)。利用TCGA中的表達數據和DNAJC9的表達進行相關性分析,差異均有統計學意義(P<0.01), 結果見圖8。富集分析顯示,以上基因可能參與DNA復制、細胞周期等生物過程,均參與細胞增殖、細胞凋亡和免疫細胞浸潤等生理功能。

A: DNAJC9蛋白互作網絡; B: TCGA中與DNAJC9相關基因熱圖; C: FUNRICH軟件通路富集分析。

3 討 論

LUAD早期發現與診斷、治療可以顯著改善患者生活質量,因此臨床迫切需要發現有效的診斷標志物和治療方法。HSPs在多數腫瘤細胞中表達增高,并在腫瘤的生長、增殖、侵襲、轉移和免疫浸潤等生物學過程中起重要作用,與患者預后密切相關[6]。DNAJC9作為其中一員,可能也參與了腫瘤的進展。HAMMOND C M等[7]等發現, DNAJC9通過其J結構域招募HSP70型酶折疊組蛋白H3-H4底物,在復制和轉錄偶聯的核小體組裝過程中發揮作用從而介導細胞增殖。ZHANG Z等[8]研究發現,敲除DNAJC9顯著降低了癌細胞系的細胞增殖和轉移,表明該基因與腫瘤的進展有關。LYNG H等[9]發現,在轉移性宮頸癌中,DNAJC9表達上調,且與預后明顯相關,然而該基因在LUAD中的作用機制仍不明確。

本研究通過TIMER數據庫分析發現,DNAJC9在多種腫瘤中均高表達,說明該基因在腫瘤中的表達具有普遍性。進一步分析TCGA中LUAD測序數據發現, DNAJC9在LUAD配對及非配對組織的表達均高于正常組織,且利用免疫組化方法檢測結果發現, DNAJC9蛋白在LUAD組織中的表達高于癌旁組織。預后價值是評價分子標志物臨床價值的重要指標。通過K-M法生存分析發現, LUAD中DNAJC9高表達患者總生存率、無疾病生存率和無進展生存率較低表達組降低。因此, DNAJC9有可能作為LUAD臨床診斷及預后評估的一個重要指標。

為了探討該基因影響LUAD進展及預后的作用機制,本研究評估了DNAJC9的表達與臨床病理特征的關系。在基于患者性別、種族、分期以及有無淋巴結轉移等亞組分析中,與正常組織組相比, DNAJC9在LUAD患者組織中的表達增高。本研究還發現, DNAJC9在LUAD突變組和無TP53突變組的表達差異有統計學意義,表明該分子在LUAD中的表達水平與腫瘤是否存在TP53突變可能有關。TP53為一種典型的抑癌基因,在細胞生長分裂和細胞損傷修復方面起著主要作用。TP53基因發生突變時,無法抑制細胞分裂和復制,導致癌癥發生[10]。本研究發現,在TP53突變的腫瘤組織中DNAJC9顯著高表達,說明該基因有可能是通過調節TP53突變而導致腫瘤進展,從而影響患者預后。

本研究還探討了DNAJC9在LUAD中高表達的上游機制。DNA甲基化是調控基因表達的重要機制,與腫瘤發生發展有重要關系。DNA甲基化對應于基因表達,一般來說,活性轉錄的基因在啟動子和增強子處缺失DNA甲基化,但含有高水平的基因體DNA甲基化,與基因表達呈負相關。本研究通過UALCAN數據庫分析DNAJC9在LUAD中的表達與甲基化的關系,顯示DNAJC9在LUAD中的DNA甲基化與轉錄表達呈負相關。因此,通過啟動子甲基化對新的腫瘤抑制基因的識別可以揭示LUAD發生中的腫瘤抑制途徑,并探索診斷和治療LUAD的新方法。

免疫治療作為目前LUAD治療一種重要方法,在臨床治療中發揮著越來越重要的作用。腫瘤免疫浸潤在惡性腫瘤的進展過程中發揮著關鍵作用[11]。ROCHA P等[12]研究顯示, CD73在早期LUAD的免疫病理生物學中具有潛在意義,其高表達可以作為機體免疫應答的一個靶標。既往研究[13]顯示, TTC21A可以作為評估LUAD預后和免疫細胞浸潤水平潛在的生物標志物。基于此,探討DNAJC9的表達在LUAD免疫浸潤及治療中的作用尤為重要。本研究分析發現,DNAJC9基因的表達與B細胞、中性粒細胞的免疫浸潤水平均有顯著相關性,表明DNAJC9有可能調控LUAD細胞的免疫浸潤水平。此外,本研究的ssGSEA分析顯示, DNAJC9的表達與T細胞、DC細胞、NK CD56dim細胞、巨噬細胞、Mast細胞、CD8 T細胞、B細胞、T輔助細胞、調節性T細胞、Th17細胞和Th2細胞具有顯著相關性,提示LUAD患者DNAJC9高表達可能影響腫瘤免疫反應。為了進一步驗證DNAJC9在LUAD免疫浸潤中的作用,本研究利用GEPIA數據庫分析了DNAJC9表達與B細胞、中性粒細胞的表面標志物的關系,并分析了DNAJC9與常規免疫檢查抑制點基因的關系發現,CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3的表達水平與該基因的表達呈正相關, CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3靶點抑制劑已在臨床免疫治療中發揮了重要作用。因此, DNAJC9表達有可能為LUAD免疫浸潤檢測及治療提供一定參考。

為了探討DNAJC9的分子作用機制,本研究預測分析了與DNAJC9相互關聯的蛋白,主要有MCM6、RRM1、NASP、FEN1、DUT、RFC4、FAM149B1、MSH2、SMC2、MCM2。其中, MCM6是一種重要的DNA復制調控因子,在維持細胞周期中起著至關重要的作用。ZENG T等[14]研究發現,持續增高的MCM6表達促進了肝細胞癌(HCC)的形成、發展和進展。另外,研究[15]顯示, MCM6的高表達導致腎透明細胞癌患者腫瘤進展、轉移。為了進一步探討DNAJC9在LUAD發生、發展中的下游調控機制,本研究對與DNAJC9相關的蛋白進行了功能富集分析,而相關信號通路主要富集于DNA復制、DNA修復和細胞周期檢查點信號通路,提示DNAJC9在LUAD中可能通過調控相關分子影響生物合成,改變細胞周期等相關通路,進而調控LUAD的發生、發展。

綜上所述, DNAJC9在LUAD中呈高表達,且其高表達與患者的生存預后相關,該分子有可能參與LUAD細胞免疫浸潤過程,表明DNAJC9可能作為LUAD的診斷和預后標志物以及免疫治療靶點,但還需要進一步研究和實驗。