子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中超保守核糖核酸339的表達(dá)及其臨床病理意義

仇 姝, 陸紅梅, 周 潔

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院揚(yáng)州市婦幼保健院, 1. 婦產(chǎn)科, 2. 病理科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;3. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

子宮頸癌(CC)是婦科最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型[1]。CC的致病因素包括多次宮頸損傷、人類(lèi)乳頭狀瘤病毒持續(xù)感染和細(xì)菌感染等[2]。CC病理類(lèi)型包括鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)和腺癌,其中CSCC最為常見(jiàn)。CC細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥是CC常見(jiàn)的不良預(yù)后因素,最終導(dǎo)致CC患者死亡。超保守RNA(UCR)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)(bp)的基因組序列家族,在人類(lèi)、小鼠和大鼠基因組的同源區(qū)基因之間具有完全的一致性[3]。UCR具有轉(zhuǎn)錄活性,因此被命名為轉(zhuǎn)錄UCR(T-UCR)[4], 大多數(shù)T-UCR并不翻譯成蛋白質(zhì),只是通過(guò)RNA的形式發(fā)揮生物學(xué)活性。研究[5-6]表明UCR參與了人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,但UCR在CSCC中的作用仍知之甚少。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn),在腎癌中超保守RNA339(uc.339)呈高表達(dá),并與臨床特征具有相關(guān)性,預(yù)實(shí)驗(yàn)也提示在CSCC中uc.339表達(dá)水平升高。本研究探討uc.339在CSCC中的表達(dá)及其臨床病理意義,探討uc.339對(duì)CC細(xì)胞增殖的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年6月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院和揚(yáng)州市婦幼保健院婦產(chǎn)科手術(shù)切除的102例CSCC及癌旁正常宮頸組織標(biāo)本,新鮮標(biāo)本組織采集后放入液氮罐里儲(chǔ)存。CSCC診斷由病理科醫(yī)師負(fù)責(zé)?；颊吣挲g39～70歲,平均年齡54.92歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 診斷為CSCC者,分期根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2018年標(biāo)準(zhǔn)作為參考; ② 未合并其他原發(fā)性腫瘤者; ③ 術(shù)前未進(jìn)行放射治療和藥物化療者; ④ 患者簽署知情同意書(shū); ⑤ 患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 病歷資料缺失者; ② 不能配合或中途退出患者; ③ 術(shù)前接受放療和藥物化療者。

1.2 細(xì)胞和質(zhì)粒

CC細(xì)胞株C33A細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。CC細(xì)胞孵育在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)中,培養(yǎng)基中添加雙抗青霉素/鏈霉素(Invitrogen公司)。將CC細(xì)胞放置在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。uc.339-mimic及Scramble對(duì)照、si-uc.339和si-NC對(duì)照均購(gòu)自蘇州GenePharma有限公司。使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司)將uc.339模擬物或抑制物等轉(zhuǎn)染到C33A細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)分組包括uc.339過(guò)表達(dá)組及Scramble對(duì)照組、降低uc.339表達(dá)組和si-對(duì)照組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)使用Trizol從CSCC冷凍組織中提取總RNA(Invitrogen), 總RNA通過(guò)Nanodrop 2000(Invitrogen)定量。cDNA使用miScript逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒生成(Qiagen GmbH,德國(guó))。使用miScript SYBR進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR),U6小核糖核酸被用作內(nèi)參。對(duì)于mRNA研究, cDNA使用FastKing RT Kit(北京天根公司)獲得,然后使用Green qPCR Master Mix(Bimake,美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR,GAPDH被用作mRNA內(nèi)參。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。所有PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500 PCR儀器上進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件: 預(yù)變性95 ℃下30 s, 然后95 ℃下5 s至60 ℃下45 s, 共計(jì)40個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增循環(huán),所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均與內(nèi)參對(duì)比后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 相關(guān)引物序列

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后,取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CC細(xì)胞,胰酶消化充分吹打制備單細(xì)胞懸液,按每孔1×103細(xì)胞密度均勻鋪于6孔板上,置于37 ℃、50 mL/L的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d, 觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待肉眼可見(jiàn)克隆時(shí),終止培養(yǎng)。使用4%多聚甲醛固定克隆細(xì)胞30 min; 采用0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色20～30 min,洗去染色液,干燥后進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù),觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆能力。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

CC細(xì)胞(3×105個(gè)/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)后培養(yǎng)24、48、72 h時(shí),分別加入MTT溶液20 μL與DMSO溶液150 μL, 低速振蕩10 min, 采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度(OD)值。

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

通過(guò)miRGen、Targetscan以及https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast對(duì)uc.339的下游靶基因微小RNA(miRNA)進(jìn)行預(yù)測(cè)。分別構(gòu)建野生型(WT-uc.339)與突變型(MUT-uc.339)熒光素酶報(bào)告載體, WT-uc.339、MUT-uc.339分別與miR-339-5P mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)雙熒光素酶的活性。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的主要步驟: 將樣本和雙熒光素酶報(bào)告試劑盒置于室溫中,每孔加入100 μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑,迅速加入20 μL樣本,混勻后酶標(biāo)儀讀數(shù),空白對(duì)照組為細(xì)胞裂解液對(duì)照; 每孔中再加入100 μL海腎熒光素酶試劑,混勻后讀數(shù)。比值計(jì)算: 海腎熒光素酶測(cè)定值除以螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)定值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CSCC組織中uc.339的表達(dá)情況

102例CSCC組織中, qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示, uc.339在癌組織中表達(dá)水平為(5.79±1.86), 高于癌旁正常宮頸組織的(1.72±1.36), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.410,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

兩者比較, ?P<0.05。圖1 2種組織中uc.339的表達(dá)(n=102)

2.2 uc.339的RNA表達(dá)水平與CSCC臨床特征的關(guān)系

根據(jù)uc.339表達(dá)水平將CSCC病例分為高表達(dá)組82例(表達(dá)量高于正常宮頸組織)和正?；虻捅磉_(dá)組20例(表達(dá)量等于或低于正常宮頸組織)。分析顯示uc.339的表達(dá)與宮頸鱗癌的腫瘤大小(Pearson′sR=7.909)和病理分級(jí)(Pearson′sR=-4.859)密切相關(guān)(P<0.05), 而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05), 見(jiàn)表2。

表2 宮頸鱗癌組織中uc.339的表達(dá)及其病理意義

2.3 uc.339對(duì)CC細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的影響

MTT實(shí)驗(yàn)表明, uc.339過(guò)表達(dá)組72 h時(shí)的OD450 nm值為(0.93±0.05), 高于Scramble對(duì)照組的(0.64±0.04), 而降低uc.339表達(dá)組72 h時(shí)的OD450 nm值為(0.35±0.02), 低于si-對(duì)照組的(0.69±0.03), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,uc.339過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞克隆數(shù)目多于Scramble對(duì)照組,而降低uc.339表達(dá)組的細(xì)胞克隆數(shù)目少于si-對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 uc.339下游microRNA的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)[8]uc.339的下游miRNA, 包括miR-95-5P、miR-663b和miR-339-5P。通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn),在C33A細(xì)胞中改變uc.339的表達(dá)后僅有miR-339-5P隨之變化,即過(guò)表達(dá)uc.339后, miR-339-5P的表達(dá)水平下降; 降低uc.339表達(dá)后, miR-339-5P的表達(dá)水平升高,提示miR-339-5P是uc.339的下游靶基因。見(jiàn)圖3。進(jìn)一步結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), uc.339基因序列中含有與miR-339-5P互補(bǔ)的核苷酸序列; miR-339-5P過(guò)表達(dá)可降低WT-uc.339的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而對(duì)MUT-uc.339的熒光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05), 提示miR-339-5P與uc.339的結(jié)合是特異性的, miR-339-5P是uc.339的直接下游靶基因。見(jiàn)圖4、表3。在102例標(biāo)本中,通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)得出miR-339-5P在CSCC中的表達(dá)水平為(0.75±0.11), 低于癌旁正常組織的(2.81±0.48), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A: 細(xì)胞克隆形成圖; B: uc.339過(guò)表達(dá)組與Scramble組、降低uc.339表達(dá)組與si-對(duì)照組的克隆形成數(shù)目比較(2組比較, ?P<0.05)。圖2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖4 uc.339與miR-339-5P的靶向結(jié)合示意圖

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證uc.339/miR-339-5P對(duì)增殖影響

改變uc.339和miR-339-5P表達(dá)后,觀(guān)察對(duì)增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分為6組,即過(guò)表達(dá)uc.339組(1組),敲低uc.339表達(dá)組(2組),過(guò)表達(dá)uc.339組+過(guò)表達(dá)miR-339-5P組(3組),敲低uc.339表達(dá)組+敲低miR-339-5P表達(dá)組(4組),過(guò)表達(dá)uc.339組+敲低miR-339-5P表達(dá)組(5組),以及敲低uc.339表達(dá)組+過(guò)表達(dá)miR-339-5P組(6組); 另設(shè)立對(duì)照組(NC組,未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒)。結(jié)果顯示,上述各組中miR-339-5P的表達(dá)是隨著uc.339和miR-339-5P的表達(dá)改變而改變。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí),過(guò)表達(dá)miR-339-5P可以抑制uc.339對(duì)CC細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,而降低miR-339-5P的表達(dá)可進(jìn)一步激發(fā)CC細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)CC細(xì)胞的生長(zhǎng)。見(jiàn)圖5、表4。

與NC組比較, ?P<0.05。圖5 各組miR-339-5P的表達(dá)

表4 回復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)CC細(xì)胞增殖活性(OD值)的影響

3 討 論

CC細(xì)胞來(lái)源于宮頸移行帶交界處的鱗狀細(xì)胞及宮頸管內(nèi)的柱狀細(xì)胞[1]。近年來(lái),隨著中國(guó)宮頸細(xì)胞學(xué)涂片早癌篩查的普及,CC及其癌前病變能被早期發(fā)現(xiàn)和診療,這也使得CC的發(fā)病率和病死率出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)[9]。在非編碼RNA中,有一類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA被命名為超保守RNA(UCR), 其在人類(lèi)、小鼠和大鼠等高度生物中同源區(qū)基因序列具有完全一致性[3-4]。研究[3-5]表明, UCR通過(guò)RNA干擾、調(diào)控和修飾參與了編碼基因功能的調(diào)控,在腫瘤組織中UCR表達(dá)水平異常,能發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤的作用,特別是對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后產(chǎn)生重要的影響。uc.339是一種外顯子T-UCR,部分嵌入ATP5G2宿主基因中,基因序列ID為KC508659.1。研究[10]發(fā)現(xiàn), uc.339在一些腫瘤中表達(dá)水平異常,能發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)作用,例如在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌中uc.339的表達(dá)水平高于鄰近非腫瘤肺組織,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明uc.339促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。蔣記心等[11]研究認(rèn)為,在非小細(xì)胞肺癌組織中uc.339表達(dá)量顯著低于癌旁正常肺組織,與臨床分期有相關(guān)性,并與p53基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),發(fā)揮著抑癌基因的作用。在結(jié)直腸癌組織中, uc.339表達(dá)水平上調(diào),發(fā)揮致癌基因的作用[5]。在肝癌細(xì)胞的胞外囊泡中發(fā)現(xiàn)了uc.339的豐富表達(dá),能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[12]。夏群等[7]發(fā)現(xiàn)了在腎透明細(xì)胞癌中uc.339表達(dá)水平上調(diào),通過(guò)活化K-RAS信號(hào)通路,從而促進(jìn)腎癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明,在102例CSCC中, uc.339表達(dá)水平上調(diào),支持了uc.339作為致癌基因而發(fā)揮作用。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), uc.339表達(dá)水平與宮頸鱗癌的腫瘤大小和病理分級(jí)密切相關(guān),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)關(guān),表明uc.339在CSCC中表達(dá)水平越高,腫瘤細(xì)胞分級(jí)越低,腫瘤越容易增殖。腫瘤增殖后體積增大為癌細(xì)胞的惡性潛能提供了基礎(chǔ),提示uc.339是促進(jìn)生長(zhǎng)的致癌基因,該結(jié)論在MTT增殖活性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證,最終會(huì)影響CSCC患者的生存和預(yù)后。在臨床病理意義中,雖然uc.339表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.055)和TNM分期(P=0.068)無(wú)關(guān),可能與本研究獲取的標(biāo)本數(shù)量偏少有關(guān)。

通過(guò)生物信息學(xué)[8]預(yù)測(cè)uc.339的下游miRNA, 包括miR-95-5P、miR-663b和miR-339-5P。在C33A細(xì)胞中改變uc.339的表達(dá)后僅有miR-339-5P隨之變化,結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出miR-339-5P是uc.339的下游直接靶基因。miR-339-5P是一種微小RNA, 其在腫瘤組織中表達(dá)水平下調(diào),可發(fā)揮抑癌基因的作用,例如在喉癌順鉑耐藥細(xì)胞中miR-339-5P表達(dá)水平顯著下調(diào),而上調(diào)miR-339-5P可減弱喉癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,并通過(guò)靶向TAK1抑制自噬,從而降低喉癌的順鉑耐藥性[13]。在前列腺癌組織和細(xì)胞系中, miR-339-5P的表達(dá)水平下調(diào),并與Gleason評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān); 過(guò)度表達(dá)miR-339-5P則能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,表明miR-339-5P在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用[14]。在肺腺癌組織中, miR-339-5P表達(dá)水平也是下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-339-5P可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移,說(shuō)明其是一種新的肺腺癌抑制劑,通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)BCL6而發(fā)揮作用[15]。在腦膠質(zhì)瘤組織中, miR-339-5P的表達(dá)顯著低于非癌組織, miR-339-5P能降低U251細(xì)胞的侵襲指數(shù)和遷移率,機(jī)制上解釋為miR-339-5P通過(guò)抑制PTP4A1/HMGB1信號(hào)通路而抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的血管生成模擬、遷移和侵襲[16]。本研究結(jié)果表明,CSCC組織中miR-339-5P的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織,提示miR-339-5P失活與CC的進(jìn)展密切相關(guān)。對(duì)于miR-339-5P失活或表達(dá)下調(diào)的原因,本研究認(rèn)為可能是被超保守RNA uc.339直接抑制的結(jié)果,即CSCC組織中uc.339呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),從而阻礙了miR-339-5P的表達(dá),最終促進(jìn)了CC細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程。

綜上所述, CSCC組織中uc.339表達(dá)水平上調(diào),發(fā)揮致癌基因的功能; 高表達(dá)的uc.339通過(guò)下調(diào)miR-339-5P表達(dá)后促進(jìn)CC細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。